[发明专利]一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法

说明书

本发明公开了一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，涉及蛋白质活性研究领域，包括钛粉负载、储存液保存和固液分离提取使用纤连蛋白等步骤，本发明将纯钛粉表面活化后可以有效负载纤连蛋白，并保持其生物活性，储存液中高浓度的蛋白酶抑制剂及蛋白保护剂可有效防止蛋白降解，较好的维持存储过程中纤连蛋白的生物学活性。使用时，可通过固液分离的方法提取纤连蛋白而去除有害蛋白保护成分如毒性剂量的PMSF或EDTA或其他干扰实验的保护成分，简单高效的完成纤连蛋白提取使用，并不影响其在细胞实验中的活性应用及研究。

技术领域

本发明涉及蛋白质活性研究领域，特别涉及一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法。

背景技术

纤维连接蛋白(Fn)是一类细胞外基质(extracellular matrix,ECM)蛋白，在细胞与细胞、细胞与基膜间起到桥联作用，维持细胞的正常形态和功能，它可以与肝素、肌动蛋白、纤维蛋白、胶原蛋白、DNA和细胞结合。其重要作用是促进细胞的黏连和粘附，可提高细胞的贴壁率、汇合率，缩短细胞汇合时间，使细胞形态结构良好，代谢率增强及蛋白质合成速度显著提高。

对于经常需要使用的纤连蛋白，一般将纤连蛋白放在-20度保存，为了避免纤连蛋白反复冻融，一般的做法是在纤连蛋白中加入一定量的甘油，但仅仅加入甘油，可以避免纤连蛋白反复冻融，但不能有效的防止纤连蛋白的降解。且由于保护剂的成分比较多，加入的量不同对纤连蛋白的影响也不一样，所以需要一种方法来保护纤连蛋白稳定性和生物学活性。

常用的蛋白保护剂有甘油、甘露醇、聚乙二醇、甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、牛血清白蛋白等。在实际操作中很难用单一保护剂实现对纤连蛋白的有效保护，因此，为了增强保护效果，通常需要将保护剂进行搭配使用。所以需要开发更优的纤连蛋白保护剂。

现有的蛋白酶抑制剂虽然可以防止蛋白降解，但有细胞毒作用，影响纤连蛋白储存液在体外细胞实验中的应用。

LBL技术一般是先将表面带电荷的基片浸入含有带相反电荷的聚电解质溶液中，静置一段时间后取出清洗去掉吸附不牢的聚电解质，完成表面物质吸附过程。采用该法在常温下即可制备各种吸附膜层，且稳定性较好，是一种构筑复合有机/无机涂层的有效方法。LBL自组装膜可以负载多种生物分子，如多糖、蛋白质和酶等。商业纯钛(Ti)及其合金具有优良的抗腐蚀性能以及良好的生物相容性，并且已经广泛应用于整形材料、牙修复材料和心血管植入材料等领域，比如人工关节，牙植入物和心脏瓣环，无细胞毒性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：纤连蛋白的储存防降解方法妨碍纤连蛋白在细胞实验中的蛋白活性研究应用，尤其是蛋白储存液中毒性剂量的蛋白酶抑制剂对细胞的毒性作用影响纤连蛋白在细胞实验中的生物活性应用。

为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

一种保护纤连蛋白稳定性和生物学活性的方法，具体步骤如下：

(1)将纤连蛋白固定于活化后的纯钛粉表面；

(2)将固定有纤连蛋白的固体粉末加入储存液中充分混匀后-20℃保存，所述储存液中包含蛋白酶抑制剂和蛋白保护剂；

(3)使用前离心去除储存液，PBS或TBS清洗沉淀后重悬至工作浓度即得纤连蛋白工作液。

优选地，所述纤连蛋白固定于Ti表面的方法如下：

(a)纯钛粉依次用丙酮，无水乙醇和蒸馏水超声清洗两次，每次5min，干燥备用；

(b)另配制0.5M的NaOH溶液，将上述已经干燥的纯钛粉浸没在该溶液中70℃下反应24h后，充分用蒸馏水进行清洗后干燥，得到活化钛粉；