[发明专利]一种DGKγ基因的shRNA及其应用

说明书

本发明公开了一种DGKγ基因的shRNA，所述shRNA核苷酸序列为SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示。本发明采用RNAi方法下调人DGKγ基因的表达后可有效地抑制神经干细胞的增殖、迁移，影响分化后神经元的发育。本发明筛选了转染效率高，干扰效率高的shRNA或者包含该序列的核酸构建体、慢病毒，并能够特异性抑制神经干细胞的增殖、迁移，从而影响脑部发育，为脑发育相关疾病的治疗开辟新的方向。

技术领域

本发明涉及生物医药研究领域，特别是涉及一种DGKγ基因的shRNA及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是机体内广泛存在的一种双链RNA介导的序列特异性基因沉默现象，因其可高效特异地阻断体内特定基因的表达导致特异基因沉默而被广泛应用于科学研究和基因治疗。其中，shRNA即小发卡RNA或者短发卡RNA(asmallhairpinRNAor short hairpin RNA，shRNA)是一段具有茎环结构的外源性RNA序列，能够在细胞内加工成siRNA，siRNA进而与蛋白质结合形成RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)结合到同源的mRNA上并诱导其降解。shRNA的作用具有严格的靶向性，特异性靶位点的选择具有位置效应，不同的靶位点对同一基因的干扰效率有着很大的差异。

甘油二酯激酶(diacylglycerol kinase，DGK)是一种保守的脂质激酶，可以催化甘油二酯(diacylglycerol kinase，DG)转化为磷脂酸(phosphatidic acid，PA)，通过DG-PKC途径调节细胞生理活动，其非酶活性部分还可以独立地参与细胞功能。DGKγ属于第Ⅰ类DGK亚型，在脊椎动物体内主要分布于神经系统，与出生后神经元的发育和功能密切相关。为了进一步研究DGKγ在脑部发育的作用机制，本发明特异性沉默DGKγ对于其在脑发育中的作用机制至关重要，为相关脑发育疾病的治疗提供应用基础。

发明内容

基于此，本发明目的在于提供了一种DGKγ基因的shRNA及其应用，所述shRNA及其构建的慢病毒载体实现了对神经干细胞中DGKγ基因的沉默，经过编辑后的细胞中DGKγ的表达水平显著降低，为脑部发育相关疾病的治疗提供了新的方法和思路。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

本发明的第一方面，提供了一种DGKγ基因的shRNA，所述shRNA核苷酸序列为SEQID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示。

其中，SEQ ID NO:1核苷酸序列为：

CGGATGACGTTTCACCGCAAATTTCAAGAGAATTTGCGGTGAAACGTCATCCTTTT；

SEQ ID NO:2核苷酸序列为：

CGCATTGACAAGGCCAACTTCATTCAAGAGATGAAGTTGGCCTTGTCAATGCTTTT。

在一优选实施方式中，所述shRNA为如SEQ ID NO:2所示的核酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种shRNA表达载体，所述shRNA表达载体包括第一方面所述的shRNA；

优选地，所述表达载体包括病毒载体；

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

本发明的第三方面，提供了一种如第二方面所述的shRNA表达载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)根据DGKγ基因的序列设计shRNA；

(2)将shRNA插入表达载体中，得到所述shRNA表达载体。