[发明专利]一种液质联用叠氮甲烷衍生法

说明书

本发明提供的一种液质联用叠氮甲烷衍生法适用于有机磷酸化合物在生物基质中的定量检出。有机磷酸化合物及其同位素内标通过弱阴离子交换剂96孔板固相萃取洗涤生物基质后，直接用在乙醚中的重氮甲烷甲基化留在柱上的磷酸化合物，极性的磷酸化合物转化为非极性的甲基化磷酸有机化合物，这种革命性的衍生法去除了有机磷酸化合物在系统上的吸附，易于在分析柱上集中浓缩得到所期望色谱峰。

技术领域

本发明涉及生物分析技术领域，特别涉及一种液质联用叠氮甲烷衍生法作为定量分析生物基质中有机磷酸化合物的普适手段。

背景技术

有机磷酸包括单双有机磷酸和其他多重有机磷酸，被广泛地应用在干细胞移植、抗癌药物、缺血治疗以及骨骼疏松症等。但是，在定量分析生物基质中的有机磷酸时，总是面临着一系列的挑战，主要原因有：

1、超极性的磷酸基团不管在逆向柱还是在正向柱上难以形成峰形和具有难以摆脱的巨大残留；

2、来自生物基质潜在的内源性干扰峰；

3、常由于缺乏发色基团而无法用经典的高压液相紫外(HPLC-UV) 测定。

尽管前人曾企图引进富含氮原子基团增进紫外或质谱检测的灵敏度，可是在过去的三十年，所有的努力都未能达到满意的灵敏度和选择性可以支持临床前后生物分析。

为了克服有机磷酸化合物在生物基质中定量检测时的挑战，本发明旨在提供一种生物基质中有机磷酸的全新检测方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种液质联用叠氮甲烷衍生法，包括如下步骤：

S1.取定量牛血清蛋白加入到定量生物样品中，并稀释；

S2.将稀释后的生物样品上样于预处理后的硅基弱离子交换剂96孔板内，清洗干燥后加入重氮甲烷乙醚溶液将生物样品甲基化；

S3.甲基化后的生物样品进行洗脱；

S4.将洗脱后的生物样品通过液质联用仪进行分析。

其中，步骤S1中，牛血清蛋白的浓度为10mg/ml，并用水或缓冲溶液稀释。

其中，步骤S2中，先用水或缓冲溶液清洗两次，再用甲醇清洗两次。

其中，步骤S2中，干燥后添加两次重氮甲烷乙醚溶液。

其中，步骤S3中，甲基化后的生物样品用甲醇或改性后有机溶剂进行洗脱

其中，步骤S4中，洗脱后的生物样品经过蒸发重构后采用反相柱在液质联用仪中进行分析；或者直接采用类正相柱在液质联用仪中进行分析。

通过上述技术方案，本发明的优点为：

1、有机磷酸化合物在96孔板内经水和甲醇洗涤后，采用重氮甲烷乙醚溶液进行衍生化反应，使目标中的有机磷酸化合物的甲基化更具特异性和高产出，免去了许多干扰物；

2、比较经典试管衍生法，由于板上衍生基于硅胶的催化作用，有机磷酸的甲基化效率大为提高；

3、有机磷酸化合物的甲基化完成后，磷酸基团与胺基的离子键消失了，甲基化的磷酸有机化合物很容易被甲醇洗脱下来直接可用于液质联用仪的分析。

具体实施方式

本发明提供了一种液质联用叠氮甲烷衍生法，包括如下步骤：

S1.取100μl浓度为10mg/ml的牛血清蛋白加入到100μl生物样品中，并用水或缓冲溶液稀释；

S2.将稀释后的生物样品上样于预处理后的硅基弱离子交换剂96孔板内，先用400μl水或缓冲溶液清洗两次，再用甲醇清洗两次，干燥后加入两次重氮甲烷乙醚溶液将生物样品甲基化；