[发明专利]一种斑马鱼中条件性诱导tcf3a基因敲除用于研究肌肉生长的方法

权利要求书

1.一种斑马鱼中条件性诱导tcf3a基因敲除用于研究肌肉生长的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)在斑马鱼tcf3a的第4个外显子两端的内含子中寻找两个核酸酶的特异识别位点，所述的特异识别位点为sgRNA1靶点和sgRNA2靶点；所述的核酸酶为CRIPSR核酸酶和Cas9核酸酶；

(2)构建非同源末端连接的敲入质粒，敲入质粒含有左同源臂和右同源臂中，左同源臂含有核酸酶识别位点sgRNA1，右同源臂含有另一个核酸酶识别位点sgRNA2，左右臂之间含有需要置换的外源基因序列，包括第4个外显子两侧的loxP位点和可用于筛选的心肌细胞标记红色荧光蛋白；利用显微注射将核酸酶体系注射到斑马鱼受精卵中；将注射的受精卵培养成鱼，通过荧光和基因型鉴定确认tcf3a条件性敲除斑马鱼；所述的核酸酶体系包括Cas9蛋白或产生Cas9蛋白的mRNA，sgRNA1和sgRNA2，tcf3a敲入质粒；sgRNA1的靶点序列为：GGACGCAGCTATCAGTGGCGT；sgRNA2的靶点序列为：GCTGGTCTAGTGCTGATCTC；

(3)构建标记斑马鱼肌肉的表达质粒，表达质粒使用斑马鱼mylpfa启动子驱动CFP荧光蛋白表达，并在两端加入转座子序列；

(4)将上述标记质粒、Cre mRNA和tol2转座酶的mRNA共同注射至tcf3a条件性敲除品系内交产生的胚胎中，3天后斑马鱼胚胎用于鉴定tcf3a的删除、整体表型观察和肌肉的表型观察。

2.根据权利要求1所述的斑马鱼中条件性诱导tcf3a基因敲除用于研究肌肉生长的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的左同源臂序列如SEQ ID NO：1中的第7-563位所示，所述的右同源臂序列如SEQ ID NO：1中的第3253-3676位所示，所述的右臂之间含有需要置换的外源基因序列如SEQ ID NO：1中的第543-2710位所示。

3.根据权利要求2所述的斑马鱼中条件性诱导tcf3a基因敲除用于研究肌肉生长的方法，其特征在于：在步骤(2)中，所述的构建非同源末端连接的敲入质粒的左同源臂、右同源臂，以斑马鱼基因组为模板，并在PCR引物加入酶切位点和保护碱基扩增获得；第四个外显子两个loxP位点间的序列，以斑马鱼基因组为模板，以loxP和frt融合序列PCR引物扩增获得loxP-tcf3a_exon4-frt融合序列，PCR引物加入酶切位点和保护碱基；可用于筛选的心肌细胞标记红色荧光蛋白序列，以loxP和frt融合序列PCR引物扩增获得loxP-myl7-DsRed-pA-frt融合序列，PCR引物加入酶切位点和保护碱基。

4.根据权利要求3所述的斑马鱼中条件性诱导tcf3a基因敲除用于研究肌肉生长的方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述的斑马鱼mylpfa启动子序列如SEQ ID NO：2中的第305-2551位所示，所述的ECFP序列如SEQ ID NO：2中的第2558-3277位所示。