[发明专利]大鼠外周血Pig-a基因突变试验流式细胞术检测方法

说明书

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种大鼠外周血Pig‑a基因突变试验流式细胞术检测方法，其包括以下步骤：步骤一：目标组织细胞采集；步骤二：表面抗原染色；步骤三：核酸染料应用液染色；步骤四：染色结束后，使用双激光流式细胞仪对样本进行检测以获取数据。该检测方法使用前向角散射(forward scatter，FSC)和侧向角散射(side scatter，SSC)区别红细胞，SYTO 13标记网织红细胞，CD59‑别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)标记突变细胞，提供了一种更为简便节约的大鼠外周血Pig‑a基因突变试验流式细胞术检测方法。

技术领域

本发明涉及毒理学安全性评价遗传毒性试验技术领域，具体涉及一种大鼠外周血Pig-a基因突变试验流式细胞术检测方法。

背景技术

Pig-a基因突变试验是近年来建立和发展起来的一种反映体内基因突变终点的遗传毒性试验，主要通过检测突变细胞表面标志物表达水平来确定受试对象暴露于致突变物质后的突变水平。在哺乳动物体内，Pig-a基因位于X染色体，编码N-乙酰氨基葡萄糖转移酶复合物，后者主要参与糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)的合成。当Pig-a基因发生突变时，GPI不能正常合成，致使需要GPI锚定的细胞表面蛋白(CD59、CD55等)表达缺失，此时可使用带有荧光基团的单克隆抗体标记后通过流式细胞仪进行检测。Pig-a基因突变试验具有采样量小、对动物损伤较小、可跨物种跨组织检测等优点，其应用可弥补现有遗传毒理学实验的某些不足，对遗传毒性的评估起到至关重要的作用。

目前国内外已有的大鼠外周血Pig-a基因突变试验流式细胞术检测方法主要有两种。一种是使用前向角散射(forward scatter，FSC)和侧向角散射(side scatter，SSC)区别红细胞，SYTO 13识别网织红细胞，CD59-藻红蛋白(phycoerythrin，PE)识别突变细胞。另一种是通过HIS49-biotin识别红细胞，CD71-PE识别网织红细胞，CD59-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)识别突变细胞。该两种方法涉及的操作步骤存在操作复杂、成本较高的缺陷：荧光染料组合发射光谱存在重叠，导致方法操作步骤增加，且灵敏度较低；部分方法需要破坏或除去白细胞以排除干扰，致使操作步骤较繁琐；现有两种方法检测成本均较高。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的技术问题，提供一种大鼠外周血Pig-a基因突变试验流式细胞术检测方法，使用FSC和SSC区别红细胞，SYTO 13标记网织红细胞，CD59-别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)标记突变细胞，提供了一种更为简便节约的大鼠外周血Pig-a基因突变试验流式细胞术检测方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种大鼠外周血Pig-a基因突变试验流式细胞术检测方法，其包括以下步骤：

步骤一：目标组织采集，采集受试大鼠外周血；所采集的外周血为自然流动静脉血或动脉血，并使用1000U/mL肝素钠溶液混匀防止凝血，其中外周血与1000U/mL肝素钠溶液体积比为5:1，然后将混合的外周抗凝血置于4℃避光环境保存待检。

步骤二：表面抗原染色，将待检样本与抗体应用液混合染色；若采用双染方案进行染色，取步骤一中的外周抗凝血作为待检样本与抗体应用液按照体积比1:5进行混合，混匀后置于4℃避光环境染色30分钟；每100μL抗体应用液中包括3μg的CD59-APC和2％胎牛血清的PBS；若采用三染方案进行染色，取步骤一中的外周抗凝血作为待检样本与抗体应用液按照体积比1:5进行混合，混匀后置于4℃避光环境染色30分钟；每100μL抗体应用液中包括3μg的CD59-APC、1μg的CD61-PE和2％胎牛血清的PBS。