[发明专利]检测大肠杆菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种检测大肠杆菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法。所述试剂盒包括6条环介导等温扩增引物：6条引分别为F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。本发明解决了现有的大肠杆菌检测技术周期长、检测成本高、不能应用于现场快速检测等问题。

技术领域

本发明涉及微生物检测领域，更具体地，涉及检测大肠杆菌的特异性LAMP引物、试剂盒及方法。

背景技术

大肠杆菌(Escherichia coli)是一种普遍存在于人和动物胃肠道的共生菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的0.1％。致病性大肠杆菌胃肠道感染是全球，特别是发展中国家腹泻暴发的重要原因。随着由大肠杆菌引起的食源性疾病普遍发生，大肠杆菌已经成为了食品安全的重要检测对象。因此，快速、灵敏、可靠的大肠杆菌检测方法对预防大肠杆菌引发的食源性疾病的暴发具有重要意义。

目前对食品中大肠杆菌检测主要有三种，即传统的微生物培养鉴定法、免疫学检测方法和PCR检测方法。传统微生物培养是基于在细菌分离和培养、形态学鉴定和生化反应来进行细菌种类鉴定，操作简单，准确性较高。但存在培养时间长、操作繁琐等问题，因此其应用受到严重限制。免疫学检测方法具有良好的特异性和敏感性，但存在抗体制备需要较长的时间、抗体不易保存等问题。聚合酶链反应(PCR)技术具有较好的特异性及灵敏度，已广泛应用于大肠杆菌的检测。但是，该方法需要昂贵的仪器及专业的操作人员，不适用于现场检测。因此，迫切需要开发一种快速、灵敏、可靠的大肠杆菌检测方法。

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由日本学者Notomi等人在2000年建立的一种新型核酸扩增技术，其原理是由具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在合成新链的同时置换出原链，从而为下一轮扩增制备模板，该扩增过程不需要变性、退火等步骤，在等温条件下即可完成。经过二十年的发展，该技术具备了特异性强、灵敏度高、反应时间短、反应结果可视化、操作便携等优势，在致病菌或疾病的临床快速检测诊断中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测大肠杆菌的环介导等温扩增引物组、试剂盒及方法，根据大肠杆菌fecA基因(GenBank ID:M63115.1)设计合成6条特异性LAMP引物进行检测，可通过在反应体系中加入荧光染料或扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳进行结果判读。该检测方法操作简单、用时短、灵敏度高及特异性强。

本发明提供了一种检测大肠杆菌的环介导等温扩增(LAMP)引物，包括6条引物，所述6条引物针对大肠杆菌fecA基因(GenBank ID:M63115.1)的保守序列设计；所述6条引物包括F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.1所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.2所示，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.3所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.N0.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

本发明还提供了一种检测大肠杆菌的环介导等温扩增(LAMP)试剂盒，包括：40uM的F3 0.08μL，40uM的B3 0.08μL，100uM的FIP 0.32μL，100uM的BIP 0.32μL，80uM的LF 0.1μL，80uM的LB 0.1μL,F3和B3、FIP和BIP以及LF和LB为环介导等温扩增引物，F3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，LF的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LB的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。