[发明专利]一种猪骨髓细胞源构建巨噬细胞库的方法

说明书

本发明属于动物医学领域，公开了一种猪骨髓细胞源构建巨噬细胞库的方法，取猪骨髓处理获取骨髓细胞，以存在不同诱导因子的培养基诱导骨髓细胞分化发育成具有M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的细胞悬液。本发明构建了一种培养M1‑和M2‑极化猪巨噬细胞的新方法，该方法获得的细胞与人单核细胞来源的M1‑和M2‑极化巨噬细胞有许多相似之处，无论是对于猪的免疫学研究，还是作为模型系统的人类医学研究都是一个十分有价值的工具。

技术领域

本发明属于动物医学技术领域，具体涉及一种利用猪骨髓细胞源构建巨噬细胞库的方法。

背景技术

在已发现并报到的病毒(如猪水泡性口炎病毒、猪圆环病毒、猪痘病毒、非洲猪瘟、典型猪瘟、猪腺病毒、猪水疱病病毒、PRRS、副流感)和细菌(如沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、支原体肺炎，胸膜肺炎放线杆菌)病原体中，很多对猪具有极强的感染性，且都能在巨噬细胞内复制和/或显著改变其基因表达。这些病原体除了给全球养猪业造成巨大的经济损失外，很多都是人兽共患病原体，对人类健康造成潜在威胁。因此，关于家猪在抗病原体感染方面的免疫学研究已成为国际上广泛关注的焦点。

此外，在生物医学研究中，猪也越来越多地被选择作为感染和炎症研究的动物模型。其中原因有两个：一是家猪与人类关系较小鼠更为密切，小鼠的免疫参数与人类免疫参数的相似性不到10％，而猪的免疫参数则有80％以上的重叠；二是猪巨噬细胞与人巨噬细胞极为相似，具有广泛的模式识别受体，通过这些受体可以检测病原体上的病原体相关分子模式。

但是由于缺乏包括巨噬细胞在内的天然免疫细胞的可靠和可重复的体外培养系统，且缺乏良好的标记物和其他工具，关于猪的免疫学研究一直受到限制。

因此，很明显需要一个强大的可重复的巨噬细胞培养系统，该系统能够提供具有良好特征的前炎性反应巨噬细胞(M1-polarized macrophages，M1)和/或抗炎性反应巨噬细胞(M2-polarized macrophages，M2)猪巨噬细胞。

发明内容

为了解决现有技术中获得巨噬细胞效率较低且缺乏可靠的体外培养系统，本发明提供一种猪骨髓细胞源构建巨噬细胞库的方法。

本发明所采用的技术方案为：

一种猪骨髓细胞源构建巨噬细胞库的方法，取猪骨髓处理获取骨髓细胞，以存在不同诱导因子的培养基诱导骨髓细胞分化形成具有M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞的细胞悬液。

进一步的，所述形成M1型巨噬细胞的诱导因子为猪GM-CSF刺激因子；

所述形成M2型巨噬细胞的诱导因子为鼠M-CSF刺激因子。

进一步的，将获取到的猪骨髓细胞先置于液氮中冷冻保存，并在需要制备巨噬细胞库时对冷冻保存的猪骨髓细胞进行复苏处理。

因为骨髓细胞可以长时间保存在液氮中(可保存半年)，需要时可以取出进行诱导培养，获得巨噬细胞，比传统的现用现取更方便

进一步的，所述复苏处理步骤具体如下：

S1.先将液氮中保存的猪骨髓细胞经过热水浴处理，再转移至预热好的培养基溶液中室温离心两次；

S2.将离心后的细胞沉淀在预热的培养基中悬浮并调节细胞浓度；

S3.将细胞转移至细胞培养瓶中，并置于细胞培养箱中培养后备用。

进一步的，猪骨髓处理步骤具体如下：

Z1.取健康猪的肋骨和/或后肢股骨清洗后切去两侧末端；

Z2.采用含有抗凝剂的保护溶液从肋骨和/或后肢股骨的两端切面冲洗骨髓并收集冲洗后的含有骨髓的溶液；

Z3.将含有骨髓的溶液过滤后得到滤过液，并将滤过液用缓冲剂配置溶液室温下离心；