[发明专利]一种分子信标、其构建方法及应用

权利要求书

1.一种检测凝血酶的方法，所述方法包括以下步骤：

1）检测液的制备：将含分子信标、Tris-HCl pH=8.0、Na⁺、Mg²⁺的溶液置于离心管中，加入ddH₂O稀释，然后将溶液混匀、离心，等量分装至PCR离心管中进行梯度退火，

其中，所述分子信标包括：

两条寡核苷酸链，

其中，

所述两条寡核苷酸链中的一条为主链单链，其核苷酸序列包括：5’ 端连接序列、适配体序列以及3’ 端连接序列，所述主链单链在 5’ 端和 3’ 端分别标记淬灭基团和荧光基团或者在5’ 端和 3’ 端分别标记荧光基团和淬灭基团，并且所述主链单链具有SEQ IDNO.2的序列；

述两条寡核苷酸链中的另一条为互补短链cDNA，其无任何修饰基团，所述互补短链cDNA包含与所述主链单链中的5’ 端连接序列的部分或全部互补的5’ 端互补序列、和与所述主链单链中的3’ 端连接序列的部分或全部互补的3’ 端互补序列，以使所述淬灭基团和所述荧光基团不分开其中，所述互补短链cDNA在主链单链的5’ 端和3’ 端与主链单链互补的碱基的个数分别不低于8个，并且所述短链cDNA具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的序列；

2）线性方程的构建：通过固定分子信标的浓度，也即，体系中主链单链的最终浓度，改变凝血酶的浓度制备一系列溶液，用荧光分光光度计测定加入凝血酶前后的溶液在518nm荧光峰值强度，以凝血酶浓度x以及（F-F0）/F0构建线性方程，其中凝血酶浓度x的单位为mol/L，F表示加入凝血酶的溶液在518nm的荧光峰值强度，F0表示未加凝血酶的溶液在518nm的荧光峰值强度；

3）凝血酶的测定：测定待测的凝血酶在518nm荧光峰值强度，并代入上述线性方程，计算得到凝血酶的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1）中，主链与短链cDNA的比例为1:1-1:10。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2）和步骤3）中，荧光分光光度计的激发波长设置为490nm，发射扫描范围为500～600nm，激发和发射狭缝分别为2.5nm和5nm，扫描速度是300nm/min。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1）至步骤3）中，Mg²⁺的浓度为1-10mM。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1）至步骤3）中，Mg²⁺的浓度为5mM。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤2）中，固定分子信标的浓度为100nM，改变人Thrombin浓度，37℃孵育30min，测定体系在518nm荧光峰值强度。

7. 根据权利要求1所述的方法，其中，

所述淬灭基团为Dabcyl，所述荧光基团为FAM，或者

所述淬灭基团为BHQ2，所述荧光基团为Cy5。

8.一种分子信标，所述分子信标包括：

两条寡核苷酸链，

其中，

所述两条寡核苷酸链中的一条为主链单链，其核苷酸序列包括：5’ 端连接序列、适配体序列以及3’ 端连接序列，所述主链单链在 5’ 端和 3’ 端分别标记淬灭基团和荧光基团或者在5’ 端和 3’ 端分别标记荧光基团和淬灭基团，并且所述主链单链具有SEQ IDNO.2的序列；

所述两条寡核苷酸链中的另一条为互补短链cDNA，其无任何修饰基团，所述互补短链cDNA包含与所述主链单链中的5’ 端连接序列的部分或全部互补的5’ 端互补序列、和与所述主链单链中的3’ 端连接序列的部分或全部互补的3’ 端互补序列，以使所述淬灭基团和所述荧光基团不分开，并且所述短链cDNA具有SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4的序列。

9. 根据权利要求8所述的分子信标，其中，

所述淬灭基团为Dabcyl，所述荧光基团为FAM，或者

所述淬灭基团为BHQ2，所述荧光基团为Cy5。