[发明专利]一种酮还原酶及其在达芦那韦中间体生产中的应用

说明书

本发明实施例公开了一种酮还原酶及其在达芦那韦中间体生产中的应用，属于生物催化方法及应用技术领域，所述酮还原酶源于Starmerella magnoliae，可用于转化3S‑1‑氯‑3‑叔丁氧羰基氨基‑4‑苯基‑2‑丁醇生成(2S，3S)‑1‑氯‑3‑叔‑丁氧羰基氨基‑4‑苯基‑2‑丁醇，所述酮还原酶，其序列为SEQ ID NO.8。所述酮还原酶来源丰富，成本低，获取简单。本发明整个体系使用单酶催化，使用醇类用于辅酶循环，对设备要求低，生产过程无需高温或者冷却，能耗低，由于酶催化具有高效，专一的选择性，故以此法生产达芦那韦的关键中间体(2S，3S)‑1‑氯‑3‑叔丁氧羰基氨基‑4‑苯基‑2‑丁醇无副产物产生，纯化方便；此外反应溶剂主要为水，三废排放低，绿色环保。

技术领域

本发明属于一种生物催化方法及应用技术领域，涉及一种酮还原酶及其在达芦那韦中间体生产中的应用，尤其涉及一种酮还原酶及其在(2S，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇生产中的应用。

背景技术

酮还原酶是一种多用途催化剂，通过醛或酮的对映体选择性还原成对应醇。(R)特异性酮还原酶与(S)特异性酮还原酶具有不同特性，并且这些催化剂在光学活性醇的工业合成中被越来越频繁地用到。旋光性是许多医药和农药活性化合物选择性作用的必要条件，在一些情况下，一个对映体具有有益的药物活性，另一个对映体却具有基因毒性作用。因此，在药用和农药用活性化合物的合成中，需要使用具有所要求的立体特异性的催化剂合成光学活性醇。

达芦那韦，又名地瑞那韦，以商品名Prezista出售，是强生公司的一种用于非肽类艾滋病毒蛋白酶抑制剂，美国食品药品管理局(FDA)在2006年批准其上市。2011年美国食品药品管理局(FDA)宣布批准Prezista(达如那韦)的口服混悬液制剂。是全球第二个上市的非肽类蛋白酶抑制剂，是目前世界上主要的抗艾滋病药物之一。

(2S，3S)-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇做为制备达芦那韦的关键中间体，目前主要生产工艺有化学合成法和生物法两种，其中生物法可由相应的酮还原酶或微生物全细胞生物转化3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇获得。

公开报道显示巴西Amanda等人用生物法制备(2S，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇(DOI:10.1002/cctc.201403023)，其利用一种Ralstonia sp.来源的RasADH，不对称地还原(3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁酮以产生(2S，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇。该方法使用了辅生物法制备酶NADPH，市场价格昂贵，一定程度上限制了其应用。其底物浓度为10mg/ml折合10g/L且光学纯度仅为90％，无法满足相关医药中间体的制备需求。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中生物法制备(2S，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇成本高，底物浓度低，辅酶消耗量大，光学纯度低的技术问题。提供一种酮还原酶及其在达芦那韦中间体生产中的应用。

本发明提供的技术方案如下：

一种酮还原酶，其特征在于，其源于Starmerella magnoliae，可用于转化3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇生成(2S，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇，所述酮还原酶，其序列为SEQ ID NO.8。

优选的，所述酮还原酶的来源是大肠杆菌重组表达。

优选的，所述酮还原酶的表达质粒的密码子已经为在宿主细胞中表达而进行了优化的表达质粒的密码子。

一种生产达芦那韦中间体的方法，其特征在于，包括在与序列为SEQ ID NO.8的酮还原酶的存在下，将3S-1-氯-3-叔丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇转化生成(2S，3S)-1-氯-3-叔-丁氧羰基氨基-4-苯基-2-丁醇。