[发明专利]适用于微量细胞的RIP实验的建库测序方法

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种适用于适用于微量细胞的RIP实验的建库测序方法。该方法具体为对RIP实验的结果进行测定并分类，然后根据不同的值进行不同的建库测序。该方法适用于微量细胞，解决了DNA与蛋白，蛋白与蛋白的项目结合导致后续难以去除DNA从而干扰分析数据的问题，而且不需要使用超声打断法将DNA进行片段化，即不会影响RNA与蛋白的结合效率。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种适用于适用于微量细胞的RIP实验的建库测序方法。

背景技术

生物的基因调控和表达是极其复杂但有序的过程，RNA，尤其是非编码RNA，之前被认为是一种不具备生物学功能的物质，近年来被证实参与了多种生物学调控过程。其中，RNA与蛋白相互作用，可以结合在基因启动子区，进而调控下游基因的转录表达。

RNA免疫共沉淀技术(RNA Immunoprecipitation,RIP)是研究RNA-蛋白质在体内相互作用的标准方法。RNA免疫共沉淀技术可以定位分析体内蛋白质与RNA的作用位点，运用RIP技术与其他方法相结合，例如与高密度芯片(microarray)、测序(sequencing)、northern bolt等技术相结合可以获得整个系统内与某一特定蛋白产生项目作用的RNA序列，通过序列定位，可以进一步得出这些RNA的序列在基因组上分分布位置，作用方式，结合的靶序列等信息。

RIP技术的一般技术流程为：首先对细胞或组织进行不同时间的甲醛交联，分别裂解细胞膜及细胞核，使用超声方式将染色质打碎成一定长度范围的片段。加入抗体，抗体会特异性地与靶蛋白结合，而后通过磁珠与抗体的相互作用，将靶蛋白及与其结合的RNA以及DNA片段富集。解交联并消化蛋白后，再用DNA酶将DNA消化，最后将RNA提纯，对捕获的RNA片段逆转录建库，进行第二代测序。根据数据片段在基因组上的富集情况，进而获得全基因组水平的特定蛋白与RNA相互作用的图谱。

然而，现有的RIP-seq技术主要存在如下问题：建库效率低，不适用于少量细胞实验；交联后除了RNA与蛋白相互结合并固定以外，DNA与蛋白，蛋白与蛋白的项目结合也同样被固定，在后续实验中很难完全去除DNA的影响，导致分析数据时很难排除DNA的干扰；交联法需要将DNA进行片段化，片段化过程中一般适用超声波破碎打断，这种方法很容易影响RNA与蛋白的结合效率，从而倒是获得的RNA量大受影响。

超声打断法是对染色质进行随机打断，获得一定长度范围内的片段。因此，在靶蛋白及RNA复合物的周围也带有一些非靶蛋白特异结合的RNA序列或是其他蛋白结合的位点。这些非特异性位点在后面建库测序过程中均会被保存下来，成为靶蛋白图谱分析的干扰背景，获得宽峰，降低了检测结合位点的分辨率和准确性。

发明内容

有鉴于此，本发明在于提供一种适用于微量细胞的RIP实验的建库测序方法。

RIP实验为常规的RIP实验，具体包括以下步骤：(1)将细胞离心获得细胞沉淀A；(2)用预冷的PBS缓冲液冲洗并离心所述细胞沉淀A得细胞沉淀B；(3)用所述与细胞沉淀B等体积的核糖体裂解缓冲液重悬所述细胞沉淀B，并处理成单细胞悬液；(4)准备免疫沉淀用的免疫磁珠以及目标蛋白抗体；(5)免疫沉淀反应获得RNA-蛋白结合的复合物；(6)对所述RNA-蛋白进行处理得RNA。

具体地，步骤(3)后，所述单细胞悬液-5℃—5℃放置3-8min后，放置于-90℃—-70℃；所述PBS缓冲液的pH＝7.4；所述核糖体裂解缓冲液为：1000mM KCl,50mM MgCl2,100mMHEPES-NaOH pH 7,5％NP-40。10倍浓度储存液保存于室温，使用时用水稀释10倍，并添加1mM二硫苏糖醇l(DTT),200units/ml RNA酶抑制剂，以及不包含EDTA的蛋白酶抑制剂复合物；步骤(4)所述的免疫为A蛋白或G蛋白包被的免疫磁珠。