[发明专利]一种加速tau病理在C57BL6小鼠脑内朊样传播的方法

说明书

本发明公开了一种加速tau病理在C57BL6小鼠脑内朊样传播的方法，其包括，构建RNAi腺相关病毒载体；用病毒包装的辅助质粒和所述目的基因的RNAi腺相关病毒载体(高质量重组载体)共转染AAV‑293细胞，得到RNAi有效载体腺相关病毒；将所述病毒注入C57BL/6小鼠体内即可；还包括，构建目的基因过表达载体，用所述目的基因过表达载体和所述目的基因的RNAi腺相关病毒载体共转染293T细胞后，通过观察细胞荧光保证转染效率大于等于70％，再收集细胞提取蛋白，检测目的基因敲减情况。本发明发现rAAV9基因可以作为在脑组织递送基因的有效工具载体，加速tau病理在小鼠脑内朊样传播的速率。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种加速tau病理在C57BL6小鼠脑内朊样传播的方法。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)，俗称老年性痴呆，是多因素疾病，老化是其最主要的病因。AD拥有典型的病理特征：细胞外β-淀粉样蛋白(β-amyloid protein,Aβ)聚集形成的老年斑(senile plaque,SP)的沉积和细胞内大量的tau蛋白聚集形成神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)和广泛神经元退变。一直以来在AD研究领域都是以Aβ为中心，以Aβ为靶标作为药物开发的重点。遗憾的是AD一直是新药研发的重灾区，该领域临床试验失败率高达99.6％，过去20年来在该领域的研究几乎全军覆没，所以寻找新的靶点非常必要。

NFTs聚集的其数量和患者的痴呆程度呈明显的正相关，被认为是AD患者神经元纤维退化(neurofibrillary degeneration)的病理基础。而tau的异常过度磷酸化被认为是引起NFTs聚集和tau朊样传播的一个重要因素。为进一步证实tau病理发生、发展与磷酸化的关系，以及开发以tau为靶标的AD药物，我们拟敲降使tau发生磷酸化的酶PP2A并观察tau朊样传播的变化。

PP2A，即蛋白磷酸酶2，是一种酶，在人类中由PPP2CA基因编码，是异源三聚体，由催化亚单位C，结构亚单位A和调节亚单位B组成。是丝氨酸苏氨酸磷酸化酶，调节真核细胞中大部分的磷酸化酶，对细胞内的许多通路产生影响。

重组腺相关病毒rAAV是在非致病的野生型腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AAV)基础上改造而成的基因载体，具有免疫原性极低、安全性高、宿主细胞范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等优势，被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体之一。rAAV载体种类多样，有众多血清型，不同血清型的rAAV载体可以识别不同的细胞表面受体，表现出不同组织或细胞感染嗜亲性。

近年来，基因治疗作为全球最引人注目的新型疗法快速发展，rAAV作为基因治疗的明星载体，一直是人们广泛关注的重点。本项研究的结果显示rAAV9可以作为在脑组织递送基因的有效工具载体，通过病毒载体介导PP2A基因的敲降，研究tau病理发生的分子机制，明确tau病理聚集和朊样传播与PP2A的关系，提示了rAAV载体介导的基因治疗的可行性，亦可有助于筛选出抑制或逆转tau病理发生发展及传播的药物，为此类疾病的治疗提供了新的策略。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。为了明确tau病理发生、发展和PP2A的关系，构建了一种重组腺相关病毒rAAV9-Ppp2ca-RNAi，通过敲降PP2A，观察tau病理的变化。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种加速tau病理在C57BL6小鼠脑内朊样传播的方法。