[发明专利]一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞上C‑MET表达的免疫荧光检测方法包括8%PFA，0.4% PFA，0.3% TritonX‑100，10%山羊血清，兔抗人C‑MET、大鼠抗CD45组成的一抗混悬液100μl，荧光标记的羊抗兔、荧光标记的羊抗大鼠组成的二抗混悬液100μL，DAPI封片剂；检测方法包括外周血采集、外周血样预处理、样本分离、甲醇固定、贴膜、组化笔画圈、细胞固定、细胞穿透、封闭、一抗孵育、二抗孵育及核染色、封片及检测。本发明提供的检测方法，不用穿刺活检获取组织标本即可检测到晚期或复发肝细胞癌患者C‑MET表达情况，利用微创技术，能够实现实时动态检测。

技术领域

本发明提供了一种检测肝细胞癌患者外周血循环肿瘤细胞C-MET表达的免疫荧光试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率高，在恶性肿瘤死亡顺位中仅次于胃、食道而居第三位；在部份地区的农村中则占第二位，仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人，占全世界肝癌死亡人数的45％。肝癌平均患病年龄44岁。肝病恶性程度高，发展迅速，若治疗不及时或治疗方案选择不当，平均生存时间为半年。肝癌早期可无症状，一旦出现明显症状，约有1/3已属晚期，患者会感到肝区胀痛，尤其饭后为甚，厌食，肝大，右上腹有肿块，不明原因的消瘦、腹胀、腹泻、间断性发热、乏力、食欲减退等，

随着分子生物学的发展，中晚期肝细胞癌的免疫治疗逐渐兴起，初步的临床试验也取得了较好的疗效，目前多项III期临床试验正在开展，C-MET(cellular-mesenchymal toepithelial transition factor，间质表皮转化因子)基因属于原癌基因，编码肝细胞生长因子的跨膜受体，C-MET具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TKs)活性，C-MET酪氨酸激酶是唯一已知的肝细胞生长因子高亲和性受体，被活化后的C-Met与肝细胞生长因子(HGF)结合，可以调节机体各种组织和细胞的增殖、分化和侵袭活动。一旦构成HGF／C-MET信号通路异常活化，将促进多种肿瘤的发生和发展以及转移。

循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell，CTC）是从实体肿瘤脱落进入外周血液循环的肿瘤细胞，自1989年被发现以来，目前已有多种方法用于外周血循环肿瘤细胞的检测。近期研究表明，其检测对于评估肿瘤患者尤其是晚期肿瘤患者的预后以及选择合适的个体化治疗具有重要的临床意义。因CTC检测具有微创、实时检测等特点，被称为肿瘤的“液态活检”。

免疫荧光分析技术即将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来用以研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发出的荧光可在荧光显微镜下检出，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光(黄绿色或橘红色)，可以看见荧光所在的细胞或组织，利用定量技术测定含量，从而对抗原进行细胞定性和定位分析。

针对目前临床实践中，肝细胞癌患者C-MET检测的标本主要为肿瘤组织，来源于手术或穿刺活检，很难做到多次或实时检测。因此，检测循环肿瘤细胞(CTC)C-MET表达情况对肝细胞癌患者预后及免疫治疗疗效评估具有重要价值。