[发明专利]一种体外培育牛黄及其制备方法

权利要求书

1.一种体外培育牛黄的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1）结合胆汁酸的制备：所述结合胆汁酸为牛磺胆酸、甘氨胆酸、牛磺去氧胆酸、甘氨去氧胆酸；以牛胆汁为原料进行以下处理：

黏多糖的去除：每升牛胆汁中加入100ml 0.02%的CTAB溶液，搅拌5min，静置30min，过滤去除沉淀，得滤液；

②蛋白质的去除：用氢氧化钠将步骤的滤液pH调至10～10.5，向每升滤液中加入适量的0.02%的硫酸锌或氯化锌溶液，适量的 0.01%的氯化钙或硝酸钙溶液形成金属盐类复合物，过滤去除沉淀，得滤液；

结合胆汁酸混合物的获取：用浓盐酸将步骤②中滤液pH调至1～2，搅拌2min，静置20min，离心收集沉淀物；

结合胆汁酸的分离：将步骤收集的沉淀物与100～200目硅胶以（5～6）:（3～4）比例直接拌样，干燥上样；硅胶层析柱内径22cm，装柱100～200目硅胶量5kg，高度35cm；单次上样量500～600g，拌样硅胶量300～400g，高度5～6cm，以乙酸乙酯/甲醇/甲酸为洗脱液进行洗脱，洗脱速度5～8ml/s，具体洗脱方式：先后经过乙酸乙酯/甲醇/甲酸体积比=（50～90）:（0.7～1.3）:（0.7～1.3）洗脱45～65L得甘氨去氧胆酸，（70～130）:（1.4～2.6）:（0.7～1.3）洗脱30～50L得甘氨胆酸，随后（55～105）:（14～26）:（0.7～1.3）洗脱14～26L得牛磺去氧胆酸，最后经过（52～98）:（18～32）:（0.7～1.3）洗脱28～52L得牛磺胆酸；

2）复合胆红素钙的制备：取250L牛胆汁，加入牛磺酸，蒸汽灭菌，加入2.5L大肠杆菌、肠球菌、变形杆菌的单一菌液或者其组合菌液，进行发酵，控制发酵温度36～39℃，罐内压力0.45～0.5bar，pH值6～8，搅拌机转速50～60r/min，发酵80～90h，得发酵牛胆汁240～253L，加饱和氢氧化钙溶液，搅拌15～30min、煮沸15～20min、冷却，过滤得沉淀物11～14kg，向沉淀物中加入胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌和硫酸镁并置于高速分散机中，加100～200L纯化水搅拌1～2h，冷冻真空干燥并粉碎，得复合胆红素钙粉末25～35kg；

3）培育与成形：按照每100kg复合胆红素钙中加50～100L步骤2）中的发酵牛胆汁，100～150L纯化水，添加步骤1）获得的结合胆汁酸，助悬剂羟丙甲基纤维素，搅拌15～30min，均匀分散，静置30～60min，加酸调节pH至5.5～6.8，偏轴定向旋转培育形成类球形物，干燥得成品。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）②中，每升滤液中加入0.02%硫酸锌或氯化锌溶液以及0.1%氯化钙或硝酸钙溶液的体积均为15～25ml。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，将步骤收集的沉淀物与100-200目硅胶以5:4的比例直接拌样，干燥上样；硅胶层析柱内径22cm，装柱硅胶量5kg，装柱100-200目硅胶高度35cm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，单次上样量500g，拌样硅胶量400g，拌样硅胶高度5cm，具体洗脱方式：先后经过乙酸乙酯/甲醇/甲酸体积比=70/1/1洗脱50L得甘氨去氧胆酸，100/2/1洗脱40L得甘氨胆酸，随后80/20/1洗脱20L得牛磺去氧胆酸，最后经过75/25/1洗脱40L得牛磺胆酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2）中，向250L牛胆汁中加入7.5～15kg牛磺酸，向240-253L 发酵牛胆汁中加入240～1000L饱和氢氧化钙溶液，向过滤得的11-14kg沉淀物中加入10～15kg胆红素，1.5～3kg胆酸，0.8～1.5kg去氧胆酸，0.12～0.2kg硫酸锌，0.12～0.2kg硫酸镁。