[发明专利]用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片

权利要求书

1.一种用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片包括：封盖层、封闭层、聚二甲基硅氧烷PDMS层和加热层构成，封盖层分为上盖玻片(1)和下盖玻片(4)；封闭层由一层透明胶带或PET膜(2)组成，该胶带粘贴于PDMS层(3)的上表面，PDMS层由主通道串联各反应腔室(8)组成；各反应腔室(8)位于主通道左右两侧，芯片进样口(6)和芯片出样口(7)位于主通道前后两方，加热层(5)由陶瓷恒温加热膜片组成。

2.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述PDMS层的结构是采用软光刻技术制作成具有微通道结构的基板为模具，在模具上浇筑聚二甲基硅氧烷，固化后形成主通道和各反应腔室；各反应腔室位于主通道两侧，每个腔室可作为独立反应单元，用于环介导等温扩增。

3.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述反应腔室形状为正方形。

4.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述封盖层与所述PDMS层可以通过化学键紧密贴合在一起；该化学键是通过等离子体轰击使硅氧键打开形成羟基并在界面发生缩合反应生成的化学键。

5.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述封闭层是在芯片抽取真空后，将透明胶带或PET膜粘贴在PDMS层上面形成。

6.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述加热层的陶瓷恒温加热膜片置于PDMS层反应腔室底部，其加热温度为60～68℃。

7.根据权利要求1所述用于食品微生物检测的数字环介导等温扩增的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片通过置于真空中抽取气体，实现由通道内外气压差自发驱动的进样过程。

8.一种利用数字环介导等温扩增的微流控芯片进行食品中致病微生物核酸检测的方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

1)将模板与等温扩增反应试剂混合物混合，混合试剂具体包括内引物、外引物、BstDNA聚合酶、dNTPs、反应缓冲液以及钙黄绿素锰络合物；其中dNTPs为脱氧核糖核苷三磷酸；

2)预先将制作好的PDMS层(3)与下封盖层(4)键合，并在真空环境中除气20分钟；快速在键合后的PDMS层(3)表面上粘贴透明胶带或PET膜(2)，并再次进行抽真空除气；

3)取出芯片，利用注射器针头扎破芯片进样口(6)处的透明胶带，利用芯片通道和外界存在压强差，使样品溶液自发注入通道和各反应单元腔室(8)；

4)再次在芯片进样口(6)加入氟化油溶液，利用芯片通道和外界存在压强差，使氟化铀自发进入通道，将通道中多余的样品溶液冲出主通道，并将样品溶液封锁在各反应腔室(8)，在芯片出样口(7)处收集多余样品溶液；

取少量PDMS和固化剂混合液滴加在被刺破透明胶带的进出口处，并在芯片上部盖上上封盖层(1)；PDMS固化之后即可对芯片进行封闭；

5)将上述芯片置于陶瓷恒温加热片(5)上，进行核酸扩增；

6)反应结束后，通过肉眼观察颜色变化情况，若反应腔室内无颜色说明检测结果为阴性；若变为绿色，则显示为阳性；也可利用荧光显微镜采集芯片上各反应单元的荧光信号，通过软件Image Pro计数阳性反应小室数目进行分析。