[发明专利]多种混合核酸中检测痕量核酸的方法

说明书

本发明专利公开了一种核酸成环与选择性核酸破环的核酸分析技术，包括对待测基因片段进行成环处理和选择性对特定环形基因片段进行破环处理。通过成环和选择性破环处理使不同核酸待测分子分别表现为环形状态与线性状态而得以区分，可用于特定基因型核酸分子的识别。

技术领域

本发明专利涉及生物医药领域，具体涉及一种核酸分析技术，特别涉及一种利用核酸 酶内切酶选择性破环特定环状核酸以达到对未被破环的核酸分子进行扩增和富集的技术。

背景技术

核酸分析和富集在基因突变的分析中意义重大。聚合酶链式反应PCR，连接酶链式反 应LCR和滚环扩增RCA等技术具有对特定区域的核酸选择性扩增的效果，也可用于全基因组扩增。但是，对体细胞突变的分析，由于大部分情况尤其是如血液，尿液，痰液等生 物标本中的体细胞突变，混合宿主和寄生微生物的复杂标本，和环境检测如水和空气特定 突变病原体的监控等情形，由于不需要分析的核酸成分所占比例太大，或突变核酸含量远 远低于野生基因的含量，选择性区分不同基因型的核酸分子和富集含量较低或含量极低的突变基因片段，具有一定实用价值。

多种生物技术可用于特定基因型的富集，如由耐外切酶消化的硫化修饰引物与高保真 DNA聚合酶组成的突变敏感性分子开关(1)，针对设计终止密码子的蓝白菌落富集技术(2)， 自杀基因与他杀基因联合构成的富集体系(3)，利用耐高温限制性内切酶与聚合酶偶联的 边消化边扩增技术(4-6)，均可以在一定条件下对特定性质的突变核酸进行富集。但更高富 集效率和具有更广泛应用范围的核酸富集技术，迄今仍是生物技术领域有待发展的实用技 术。(专利为6：ZL201510684160.7:一种变换核酸基因型的方法)

鉴于特定基因型的富集方法中，包括耐高温限制性内切酶的种类有限和去磷酸化处理 及菌落斑技术在通量上的局限和比较费时等不足或缺点，为解决上述本发明由此而来。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种从多种混合核酸中检测痕量核酸的核酸分析 技术，达到高效且既可以区分遗传性突变、也可以区分表观突变的目的。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：从多种混合核酸中检测痕量核酸的 方法，其包括如下步骤：

(1)对含有多种混合核酸的待测样本，进行线性核酸分子的环化，

(2)采用具有核酸内切功能的核酸酶对对环化后的核酸进行选择性破环，使待测样本 中不需要富集的核酸靶点从环形核酸变为线性核酸，

(3)对步骤(2)得到的核酸分子进行检测识别，检测存留形态是线性核酸还是环形核酸。

优选地，当需要识别与富集的核酸靶点为大量长度不一的未知情况时，在步骤(1)前， 先将待测样本中的线性核酸分子的末端填平补A，然后用核酸链接酶链接接头以形成环化核 酸。

优选地，当需要识别与富集的核酸为已知确定数量的靶点时，在步骤(1)前，先采用 5’末端带限制性内切酶位点的引物进行扩增，然后利用相应的内切酶处理扩增产物、核酸连 接酶使其形成环化核酸。

优选地，当需要富集的核酸为已知的一定数量的靶点时，在步骤(1)前，采用5’末端 带LoxP位点的引物进行扩增，然后利用cre重组酶的重组功能形成环化核酸。

优选地，在步骤(1)，用具有将线性核酸连接成环形的核酸酶，进行线性核酸分子进 行环化处理。更优选地，所述核酸酶为核酸连接酶。

优选地，在步骤(2)，所述具有核酸内切功能的核酸酶为天然核酸内切酶；本发明又 一优选技术方案中，所述具有核酸内切功能的核酸酶为基因工程核酸内切酶。

优选地，在步骤(3)中，对待测核酸分子进行识别的存留形态是线性还是环形的方法， 包括电泳方法、核酸外切酶外切法、PCR扩增法、滚环扩增法、飞行质谱、高压液相法、高分辨溶解曲线。