[发明专利]人源细胞悬浮培养的培养基组合及溶瘤痘苗病毒的制备方法

说明书

本发明涉及溶瘤病毒制备技术领域，尤其涉及人源细胞悬浮培养的培养基组合及溶瘤痘苗病毒的制备方法。本发明提供的培养基组合，包括EX‑Cell^® 293培养基、VirusPro^®CD HeLa培养基、DMEM培养基中至少两种。该培养基组合能够使悬浮培养的HeLa S3细胞能保持高密度高活率生长，并且支持搅拌式生物反应器大规模培养细胞扩增病毒。同时，悬浮培养HeLa S3细胞扩增痘苗病毒，病毒滴度也稳定在较高水平，实现了溶瘤痘苗病毒的大规模生产。

技术领域

本发明涉及溶瘤病毒制备技术领域，尤其涉及人源细胞悬浮培养的培养基组合及溶瘤痘苗病毒的制备方法。

背景技术

溶瘤病毒（Oncolytic Virus）能靶向性杀伤肿瘤细胞，而不会对正常组织细胞产生杀伤作用。同时，溶瘤病毒可以杀伤那些抗凋亡的肿瘤细胞，并且不会对现有的抗肿瘤治疗方案产生拮抗作用，适合联合用药。

痘苗病毒(Vaccinia Virus，VACV)曾在全球杀灭天花的行动中得到广泛应用，人类对痘苗病毒的生物学性状和致病机理有着较为深入的了解。同时，痘苗病毒复制快，副作用明确，自身基因组大，可插入大片段外源基因，适合经过改造后用于肿瘤的治疗。曾用于天花预防接种的痘苗病毒包括NYCBH株、Lister株、哥本哈根株、天坛株、Ankara株等。

近年来，国内外一些学者致力于将重组痘苗病毒(rVACV)应用于肿瘤的生物治疗，其中一些研究已取得较大突破，特别是法国Transgene公司关于溶瘤痘苗病毒的研究走在前列，虽然溶瘤痘苗病毒项目JX594（Pexa-Vec）肝癌III期临床失败，但其同类产品TG6002，正在英国开展针对结直肠癌的I/IIa临床实验。该产品使用了新的基因编辑技术并移除了两个基因，预期会有更好的疗效。同时，天士力创世杰(天津)生物制药公司获得了该产品的国内全部开发权，代号为T601，并于2019年4月18日收到国家药监局核准签发的重组溶瘤痘苗病毒注射液T601药物临床试验通知书，适应症为晚期恶性消化道实体肿瘤。另外，Genelux公司的主要候选产品GL-ONC1，一种改良的溶瘤痘苗病毒，可通过腹腔注射和静脉注射给药，已经完成治疗头颈癌Ⅰ期临床试验，显示出良好的安全性和疗效。

目前，用于培养溶瘤痘苗病毒的宿主细胞有BSC-1、Vero、HeLa S3、MRC-5、BHK-21等，但人源细胞并不多，且多为贴壁生长，培养基几乎全都需要添加血清。血清组分的复杂性和不确定性，以及其中存在病毒等病原微生物污染的潜在风险，影响着病毒的生产工艺和质量，给溶瘤病毒的使用带来了不容忽视的安全隐患。

随着无血清培养技术的不断进步，很多细胞（如CHO细胞、HEK293细胞、BHK-21细胞等）可以实现无血清悬浮培养，但是仍然有很多细胞（如VERO细胞）的贴壁特性难以改变，培养方式仍以方瓶和滚瓶的内表面为介质贴附生长。这些培养体系所能提供的细胞生长面积有限，细胞培养规模的放大只能依赖培养单元的增加，由此给病毒生产带来诸如污染风险大、生产效率低、产品质量可控性差及人力资源需求大等弊端。微载体培养是融合悬浮培养优点的一种特化的细胞贴壁培养模式，不仅大大增加了单位培养体积中细胞赖以生长的表面积，同时也加大了细胞培养过程监测和控制及细胞培养规模放大的可实施程度。但与悬浮培养相比，微载体的使用也加大了细胞培养的成本，引入了诸多不可控的风险，也给培养规模的放大带来了不便。

有些细胞虽然被成功悬浮驯化，可以完全无血清悬浮培养，但其改变生长特性后，扩增病毒能力显著下降。Transgene公司公布的专利曾报道，HeLa S3细胞悬浮驯化后，扩增JX594（Wyeth株）病毒的能力明显下降，单细胞产毒从72 pfu/cell（贴壁附着培养）降至0.4pfu/cell（悬浮培养），失去了商业应用价值。另外，HeLa S3细胞对剪切力敏感，在悬浮培养时，使用摇瓶培养可以生长良好，一旦放大至反应器中搅拌培养时，细胞则不能正常生长，且细胞活率会急剧下降。综上，人源细胞的悬浮培养的效果对溶瘤痘苗病毒的生产存在重大影响。但目前，人源细胞的悬浮培养仍存在密度不足、活率较低的问题。