[发明专利]Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合及其反应体系和应用

说明书

本发明公开了Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合及其反应体系和应用。本发明首先公开了Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合，该组合包括单克隆抗体4A8和单克隆抗体9B7。本发明进一步公开了上述抗体组合在降低Taq DNA聚合酶的非特异性扩增和/或保证Taq DNA聚合酶的热稳定性中的应用及包含上述组合的反应体系及试剂盒。本发明上述抗体组合及优化的反应液在低温度条件下能够充分封闭Taq DNA聚合酶的活性区域，有效降低非特异性扩增并保证酶的热稳定性，在扩增的循环数更高的条件下仍可有效维持酶活性的持久性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。更具体地，涉及一种Taq DNA聚合酶单克隆抗体组合及其反应体系和应用。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术被广泛应用于分子生物学实验中，在体外几小时就可以将1个DNA分子扩增10⁹倍。PCR技术类似于双链DNA的天然复制过程，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。DNA聚合酶是实现DNA复制的关键。

Taq DNA聚合酶是一种从水生栖热菌(Thermus aquatcus)YT-1中分离得到的耐热的DNA聚合酶。PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速、简便及重复性好等特点。但是，这些耐热的DNA聚合酶在低温条件下，仍有一定聚合酶活性，当引物3’端少数几个碱基与非扩增目标区的模板DNA序列发生配对时，很容易产生非特异性的扩增以及产生引物二聚体。目前，可以通过很多途径来提高Taq DNA聚合酶的最适反应温度，达到热启动的目的，如通过物理隔绝法、化学修饰法、设计特殊的引物或者用基因工程的方法对酶进行突变和改造。

对Taq DNA聚合酶进行改造是一种常用的方法，例如用基因工程的方法去除TaqDNA聚合酶N端278个氨基酸，并且进行E626K和I707L突变，使得酶的最适工作温度升高，提高了PCR反应的特异性，减少了非特异性的扩增。但是此方法对于酶的长期稳定性提升有限(Milko B.Kermekchiev,Anatoly Tzekov and Wayne M.Barnes.Cold-sensitive mutantsof Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[J].Nucleic Acids Research,2003,31(21):6139-6147.)。

对Taq DNA聚合酶进行化学修饰而得到的AmpliTaq Gold和Hotstart Taq这两种酶，虽然可以降低PCR过程中的非特异性扩增，但这两种酶的激活需要经过95℃孵育5至15分钟且反应的最适pH需小于等于8.3，这样容易导致DNA的脱嘌呤和断裂，影响了酶的长期稳定性和保真性(Cheng,S.,Fodder,C.,Bames,W.M.and Higuchi,R.Effectiveamplification of long targets from cloned inserts and human genomic DNA[J].Proe.Natl Acad·Sci.,1994,91:5695-5699.Barnes,W.M.Tips and tricks for longand accurate PCR[J].Trends Biochem·Sci,1994,19:342.)。