[发明专利]一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法

说明书

本发明涉及一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，对待鉴别的样品进行前处理，对处理后的样品进行拉曼图谱采集，对采集到的拉曼图谱进行去背景和归一化处理，利用处理后的图谱进行细菌真菌鉴别。与现有技术相比，本发明方法操作简单，在进行拉曼测试前不需要进行复杂的样品前处理。本方法测试所需菌量少，不需要进行增菌培养，可大大缩短检测时间，快速给出鉴别结果。利用细胞的拉曼图谱可以反应细胞化学成分的特点，通过比较细菌和真菌的拉曼图谱的特异峰位来准确鉴别细菌和真菌，可排除肉眼观察细胞形态大小并主观判断造成的误差。

技术领域

本发明属于微生物鉴定技术领域，尤其是涉及一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法。

背景技术

细菌和真菌的鉴别具有非常重要的临床意义，感染早期对细菌和真菌感染作出鉴别可以帮助临床医生制定针对性治疗方案，为临床选择有效抗菌药物提供参考，以减少广谱抗菌药物的不恰当使用，同时降低患者的经济负担。

常用的细菌和真菌鉴别方法主要有染色法、生化法和免疫学、分子生物学检测法。临床用于细菌和真菌判别的染色法主要是革兰染色法，染色后真菌为革兰氏阳性，呈现深紫色，大小约10～100μm；革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌分别呈现深紫色和红色，大小约1-10μm，通过镜下观察菌体形态大小可初步鉴别细菌和真菌，但这种方法不适用于体积比较小的真菌鉴别，且依靠人工判读，容易出现错误。生化法是临床细菌和真菌鉴定的“金标准”，该方法尽管较为准确，但耗时较长，难以满足临床需求。应用免疫学和分子生物学技术进行感染微生物检测为培养时间长、难培养或不能培养的微生物鉴定提供了一个重要手段，使感染的诊断早期、快速、准确。但这两种方法检测成本高、且对实验室要求高，很多医院不能满足检测条件。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，对待鉴别的样品进行前处理，对处理后的样品进行拉曼图谱采集，对采集到的拉曼图谱进行去背景和归一化处理，利用处理后的图谱进行细菌真菌鉴别。

进一步地，所述利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法包括以下步骤：

(1)样品前处理

对待鉴别的样品，采用离心方法去除培养液和血液，然后加入无菌水洗涤，离心去除上清后将菌液重悬，重悬液滴加到低拉曼背景载玻片上，室温风干后进行拉曼检测；

(2)拉曼图谱采集

使用共聚焦显微拉曼光谱仪，采集菌体单细胞拉曼图谱；

(3)拉曼图谱预处理

对采集到的拉曼图谱进行去背景和归一化处理，处理后的图谱才可用于后续数据分析；

(4)细菌真菌鉴别

选择两种方法中的一种或两种方法结合使用进行细菌和真菌的判别：一种是通过比较细菌和真菌的指纹区特异峰位判别细菌真菌；另一种是通过机器学习算法对已知分类的拉曼图谱数据进行训练，建立细菌真菌鉴定数据库，将新的数据代入库中进行测试鉴定。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述待鉴别的样品包括纯培养的菌液或者临床感染标本，临床感染标本包括感染尿液、报阳血液等。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，用无菌水洗涤的次数建议3遍以上。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，低拉曼背景载玻片包括单晶CaF₂载玻片、BaF₂载玻片或镀铝玻璃载玻片等。