[发明专利]一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法

权利要求书

1.一种利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，其特征在于，对待鉴别的样品进行前处理，对处理后的样品进行拉曼图谱采集，对采集到的拉曼图谱进行去背景和归一化处理，利用处理后的图谱进行细菌真菌鉴别。

2.根据权利要求1所述利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样品前处理

对待鉴别的样品，采用离心方法去除培养液和血液，然后加入无菌水洗涤，离心去除上清后将菌液重悬，重悬液滴加到低拉曼背景载玻片上，室温风干后进行拉曼检测；

(2)拉曼图谱采集

使用共聚焦显微拉曼光谱仪，采集菌体单细胞拉曼图谱；

(3)拉曼图谱预处理

对采集到的拉曼图谱进行去背景和归一化处理，处理后的图谱用于后续数据分析；

(4)细菌真菌鉴别

选择两种方法中的一种或两种方法结合使用进行细菌和真菌的判别：一种是通过比较细菌和真菌的指纹区特异峰位判别细菌真菌；另一种是通过机器学习算法对已知分类的拉曼图谱数据进行训练，建立细菌真菌鉴定数据库，将新的数据代入库中进行测试鉴定。

3.根据权利要求2所述利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，其特征在于，步骤(1)中，低拉曼背景载玻片包括单晶CaF₂载玻片、BaF₂载玻片或镀铝玻璃载玻片。

4.根据权利要求2所述利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，其特征在于，步骤(1)中，低拉曼背景载玻片购于上海氘峰医疗器械有限公司，Cat No 1001。

5.根据权利要求2所述利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，其特征在于，步骤(2)中，使用共聚焦拉曼显微镜测试前进行硅片校准，使硅的拉曼谱峰位移在520.73cm，在显微镜视野中找到菌体。

6.根据权利要求2所述利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，其特征在于，步骤(2)中，拉曼图谱采集时设置采集条件为：使用532nm激光器，激光功率设置为4～15mW，积分时间5～20s，设置图谱采集范围包括细胞的指纹区图谱300～1800cm^-1。

7.根据权利要求2所述利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，其特征在于，步骤(2)中，建库时每株菌的拉曼图谱采集数量大于200个，测试数据大于10个。

8.根据权利要求2所述利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述去除背景选择线性或多项式两种算法，分别设置阶次和点数，归一化处理选择除以图谱面积或者除以最大值，在去除背景和归一化处理过程中，保证对所有图谱进行相同处理。

9.根据权利要求2所述利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，其特征在于，步骤(4)中，关于细菌和真菌的指纹区特异峰位选取，经测试分析真菌含有的特异物质有仅分布于线粒体中的Cytochrome C，其拉曼位移在750cm^-1、1128cm^-1、1583cm^-1，细菌的特异峰位有位于810cm^-1和1240cm^-1的两个最典型的RNA峰及位于1480cm^-1的酰胺II峰，利用这些特异峰位，可准确鉴别细菌和真菌。

10.根据权利要求2所述利用拉曼光谱快速鉴别细菌和真菌的方法，其特征在于，步骤(4)中，机器学习算法包括PCA-DFA、PCA-SVM、CNN；

在进行DFA和SVM分析前，先进行PCA分析，对多维数据进行降维，然后再利用DFA分析或SVM分析对降维后的复杂的变量进行线性重组，把复杂简单化，由此可以看到两个或多个组别之间的最大变化，这些变化是可转移的，所以在有新的数据代入时可以套用；

CNN采用mxnet深度学习框架，构建DenseNet神经网络，进行深度网络学习和训练，DenseNet中每一层使用前面所有层的特征作为输入，它自己的特征作为所有后续层的输入。