[发明专利]一种表达酸性β-甘露聚糖酶的基因及其载体和应用

说明书

本申请公开了一种用于表达酸性β‑甘露聚糖酶的基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。本发明还公开含有上述基因的表达盒、重组载体或重组微生物及其应用，以及利用重组菌株发酵制备酸性β‑甘露聚糖酶的方法。本发明通过全基因合成法获得的β‑甘露聚糖酶全基因序列ManT转入宿主细胞后可以稳定高效表达及遗传，其表达的酸性β‑甘露聚糖酶耐温耐酸性好，且放罐酶活可达32000U/mL，是优化前酶活的2倍。

技术领域

本申请涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种用于编码酸性β-甘露聚糖酶的基因，及其载体和应用。

背景技术

β-甘露聚糖是存在于细胞壁和植物种子中主要的一种半纤维素。β-甘露聚糖酶是一种内切糖苷水解酶，水解甘露聚糖的β-1,4-D-甘露糖苷键，生成甘露寡糖。β-甘露聚糖酶来源丰富，分为植物来源(如豆类、刺槐、稻草等)、动物来源(如蜗牛、海洋软体动物等)及微生物来源。由于微生物资源广泛，易培养，操作提取过程简单，而且产生的β-甘露聚糖酶活性相对较高，在极端环境中可筛选到对温度、酸度等耐受性好的β-甘露聚糖酶，所以微生物来源的β-甘露聚糖酶具有更广的适用范围，在生产生活上也得到了更大的推广与应用。

目前国内外对甘露聚糖酶的报道主要集中在对菌株的分离筛选、培养条件优化和甘露聚糖酶基因的改造。例如，通过诱变选育芽抱杆菌AM-001的甘露聚糖酶的酶活力由36U/ml提高到了430U/ml；美国ChamGen公司选育的迟缓芽孢杆菌产甘露聚糖酶活力为400U/ml。随着分子生物学技术的发展，利用工程菌异源高效表达生产甘露聚糖酶是当前的主要手段。利用毕赤酵母表达生产来自曲霉的甘露聚糖酶其酶活达到约343U/ml(李松瑜等，2009，生物技术通讯)，但其在表达量及酶学性质方面仍然不能完全满足实际应用的需要。在饲料行业中，β-甘露聚糖酶的添加主要用于降低食糜粘度，提高动物对饲料的利用率等。甘露聚糖酶在饲料中的应用的关键要素是需要有较好耐高温特性和耐酸性，这是由于饲料制粒时需要在高温环境下进行，不耐高温的甘露聚糖酶的活性将受到较大损失。另外，尽管消化碳水化合物的主要过程发生在中性微酸的小肠和其它消化道中，但是食物或饲料还是要经过胃部的酸性环境，耐酸性好会降低酶活损失。目前，能产甘露聚糖酶的菌株有里氏木霉、硫色曲霉、枯草芽孢杆菌、黑曲霉等。其中，分离到的黑曲霉(Aspergillus niger)产生的甘露聚糖酶能够较好地满足生产需要，但是其产生的β-甘露聚糖酶产量低，很难满足工业化生产需要，优化前菌株的β-甘露聚糖酶最适作用温度是50℃，最适作用pH是5.50，优化前菌株的β-甘露聚糖酶在pH3.0，处理30min，酶活存留率仅为32％。因此，利用基因工程技术优化酶的基因，提高酸性甘露聚糖酶的酶学性质及产量或酶活表达量仍然是研究的重点。

发明内容

本发明根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化对SEQ ID NO.1所示的原始β-甘露聚糖酶基因，合成优化后的β-甘露聚糖酶基因ManT转入宿主细胞后可以稳定高效表达及遗传，发酵生产的酸性β-甘露聚糖酶的核苷酸序列与优化前的同源性为75.34％，酶的氨基酸序列未发生改变，但其表达的酸性β-甘露聚糖酶放罐酶活和酶学性质均大幅提高。

本发明提供了一种用于表达酸性β-甘露聚糖酶的基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明还提供了一种含有上述基因的表达盒、重组载体或重组微生物。

本发明进一步提供了一种表达载体，所述表达载体包含上述的基因。

在根据本发明的一个实施方案中，所述表达载体为包含如上述的基因的pPICZα质粒；优选为pPICZαA质粒。

在根据本发明的一个实施方案中，所述的基因经EcoRI和NotI限制性内切酶酶切后连接到pPICZαA质粒中。

本发明的再一方面提供了一种用于表达β-甘露聚糖酶基因的重组菌株，所述重组菌株包含上述的表达载体。