[发明专利]一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法

说明书

一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法，属于基因工程技术领域。针对现有多轮基因编辑方法费时费力的问题，本发明提供了一种基因编辑工具，包括如下三种sgRNA表达母质粒：pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒，其中，每种母质粒除能表达用于编辑目的基因的sgRNA外，还能表达靶向另外两种母质粒中的一种的sgRNA；在实施基因编辑过程中，由上述三种母质粒构建的基因编辑质粒循环使用时，宿主细胞中先使用的基因编辑质粒或筛选标记被后使用的基因编辑质粒所消除。本发明缩短了编辑周期、加快了多轮基因编辑速度，更少的培养次数还可以减少基因组自发突变的可能。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法。

背景技术

基因编辑被广泛地应用到多种物种的改造，被广泛地应用于基础科研以及应用研究。比如通过基因编辑的手段，大量满足不同需求的菌株被成功构建。经典的细菌基因编辑方法是通过噬菌体来源的重组酶(如λRed，RecET)介导的同源重组完成的。这种方案一般包括两个步骤。第一步，同源片段被重组进特定基因组位置，但是由于重组效率低，在此步骤必须同时引入筛选标记。第二步，去除第一步中的筛选标记，从而在多轮基因编辑中重复使用相同的筛选标记。在第二步中，尽管已有多种去除方法，但是去除效率都不是100％，因此需要挑取单克隆进行分离以及验证。这些使得现有方法费时费力。

近几年CRISPR/Cas方法也被广泛地应用到多种物种的基因编辑，其中包括多种细菌的基因组改造。Cas蛋白的高效核酸酶活性导致基因组形成双链断裂，形成了一个强大的负筛，仅有重组成功的细胞才能存活，因此这种方法仅需要一次重组。但是由于在编辑不同基因时，需要引入不同的sgRNA(即sgRNA表达模块的引入也需要筛选标记)，因此在完成一轮基因编辑之后，需要去除旧的sgRNA表达质粒，然后引入新的sgRNA表达质粒。目前的质粒去除方法也无法保证100％的效率，依然需要挑单克隆进行纯化并验证。

因此现有技术方案中，都需要筛选标记的去除或者质粒的消除步骤，而且由于消除效率不是100％，还需要额外的挑单克隆和验证步骤，这不仅费时费力，而且额外培养次数还增大了基因组自发突变的风险。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种免质粒消除的多轮基因编辑方法，能够解决现有多轮基因编辑方法费时费力(需要额外筛选标记去除或者质粒消除步骤)的问题。

为了解决上述技术问题，本发明基于CRISPR/Cas9系统，设计三个版本的sgRNA表达母质粒(pRock系列、pPaper系列和pScissors系列)，每种质粒除能表达sgRNA(sgRNA-editing)用于基因编辑外，额外表达能够靶向另外一种质粒的sgRNA(sgRNA-curing)，从而具有互相循环消除的特性：在实施基因编辑的同时，pRock系列能消除pScissors系列，pPaper系列消除pRock系列，pScissors系列能消除pPaper系列。具体技术方案如下：

一种基因编辑工具，包括如下三种sgRNA表达母质粒，分别为pRock系列母质粒、pPaper系列母质粒和pScissors系列母质粒，其中，每种母质粒除含有表达用于编辑目的基因的sgRNA外，还含有表达靶向另外两种母质粒中的一种的sgRNA；在实施基因编辑过程中，由上述三种母质粒构建的基因编辑质粒循环使用时，宿主细胞中先使用的基因编辑质粒或筛选标记被后使用的基因编辑质粒所消除。

在本发明的一个实施例中，所述pRock系列母质粒携带四环素抗性基因表达模块以及用于质粒消除的引导RNA，所述引导RNA靶向pScissors系列母质粒中阿普拉霉素抗性基因编码区GATGGGCAGGTACTTCTCCT序列；所述四环素抗性基因表达模块正义链的5’端和反义链的5’两端分别带有TCAACCCAGTCAGCTCCTTCAGG和TCAACCCAGTCAGCTCCTTCTGG序列；