[发明专利]一种检测大气环境中一类整合子基因intI1的方法

说明书

一种检测大气环境中一类整合子基因intI1的方法。该方法包括：将已知浓度的整合子基因intI1标准样品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应提取DNA，以此DNA为模板，利用设计的正向引物和反向引物对此DNA进行定量PCR扩增，并记录循环数；将获得的循环数，根据定量PCR测定目的基因intI1质粒标准样品的标准曲线；运用10倍梯度稀释法，利用已知浓度模板起始拷贝数标准样品做出目的基因的标准曲线；确定大气环境样品中一类整合子基因intI1的循环数，并根据标准曲线计算基因intI1的含量。本发明提供的目的基因引物序列和方法可以对大气环境样品中一类整合子基因intI1进行快速精确定量。

技术领域

本发明涉及环境微生物学领域，具体涉及一种检测大气环境中可移动遗传因子intI1的方法。

背景技术

抗生素是由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)所产生的能够抑制其它类微生物生长、生存的次级代谢产物，以及用化学方法合成或半合成的化合物，几乎所有种类的抗生素都是基于在环境微生物中自然发现的抗生素结构，主要用于治疗细菌感染疾病。由此导致的抗生素耐药细菌感染增加和抗生素耐药基因的多环境传播，使得世界正面临着严重的健康威胁。

随着抗生素在临床抗感染治疗上的广泛使用，细菌耐药性问题日益严重，细菌间基因的水平转移是细菌多重耐药性形成和广泛传播的重要原因。整合子系统具有捕获和表达外来耐药基因盒的能力，细菌可以通过该系统中的整合酶基因intI1编码的整合酶不断的从周围环境中捕获和积累耐药基因盒，形成巨大的耐药基因多基因座。整合子可存在于质粒、转座子等可遗动基因组件上，在同种或不同种属的细菌之间进行基因的水平转移，且整合子在多重耐药菌的形成及耐药基因的水平扩散中起重要作用。然而，目前对大气环境中的intI1研究较少，intI1可携带抗生素抗性基因通过空气传播方式进入人体，影响人类健康。

发明内容

本发明目的是解决大气环境中对不可培养微生物的基因无法进行检测的问题，提供了一种能够快速精确地检测大气环境中一类整合子基因intI1的方法。

实时定量PCR技术是一种利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增过程中每一个循环扩增产物量的变化，最终对起始模板进行精确的定量分析方法。此方法对于检测环境大气中含量较少细菌所含的基因有较好的效果，因此采用实时定量PCR技术研究大气环境中整合酶基因intI1对人体健康及环境的影响具有重要理论和实践意义。

本发明的技术方案

一种检测大气环境中一类整合子基因intI1的引物序列，包括正向引物和反向引物，其碱基序列为：

正向引物(SEQ ID NO 1)：GGCTTCGTGATGCCTGCTT；

反向引物(SEQ ID NO 2)：CATTCCTGGCCGTGGTTCT。

一种检测大气环境中可移动遗传因子——一类整合子基因intI1的方法，具体包括：

(1)将已知浓度的整合子基因intI1的标准样品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应；提取标准样品中的DNA，以此提取的DNA为模板，利用以上设计的正向引物(SEQ IDNO 1)和反向引物(SEQ ID NO 2)对此DNA进行定量PCR扩增，并记录达到荧光阈值时的循环数；

所述定量PCR的反应体系为25μL：12.5μL浓度为1×的qRT qPCR SuperMix溶液，0.3μL 0.2μM的正向引物，0.3μL 0.2μM的反向引物，10.9μL ddH₂0，1.0μLTemplate DNA。

所述DNA的提取方法为：用MO-BIO PowerSoil DNAIsolation kit试剂盒提取。采用该方法提取DNA能够在较短时间内纯化DNA，并适用于各种困难环境中的DNA提取，可从含微生物量较少的大气样品中提取足够用的DNA量。其专利技术可去除百分之百的腐殖质和PCR抑制剂。