[发明专利]基于单光纤光镊的STED超分辨显微成像装置

说明书

本发明提供的是基于单光纤光镊的STED超分辨显微成像装置。其特征是：它由用于STED成像的激光器101和激光器102、延时单元2、光束生成器3、STED成像显示仪4、用于操控微球透镜的激光器5、光功率控制模块6、反馈控制模块7、对光功率进行调节的计算机8、一个1×6光纤耦合器9、两个1×2宽带光纤耦合器10以及多根单模光纤组成。本发明基于多芯光纤的中央双包层纤芯中的螺旋光栅，将激光器发出的两束激光分别转化为高斯型激发光和中空环形损耗光，生成的两束激光光斑完全重合，并且损耗光经过延时单元的延时后，这两束激光先后照射到荧光样品上，发生受激发射损耗(STED)，获得小于衍射极限的荧光激发，最终分辨率不受光的衍射所限制，从而打破衍射极限，实现“单点”超分辨显微成像。又通过对微球透镜在二维平面内的精准操控，实现对荧光样品在二维平面上的超分辨显微成像。本发明的优点在于，提高了现有STED成像器件的灵活性与集成度，使之能够适用于微小尺度的内窥多方位超分辨成像。

(一)技术领域

本发明涉及的是基于单光纤光镊的STED超分辨显微成像装置，主要涉及光子学技术领域，更具体地，涉及一种光纤STED超分辨成像方法与装置。

(二)背景技术

由于传统荧光显微镜的分辨率存在衍射极限，近十多年来发展一些突破分辨率衍射极限的超分辨成像技术，如受激发射损耗显微(STED)技术、结构光照明显微镜(structured illumination microscopy,SIM)、光激活定位显微术(PALM)、随机光学重构显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)等。其中STED是在激光扫描共聚焦荧光显微镜的基础上引入另外一路波长比激发光较长的环形的损耗光。一个聚焦的激光束将荧光团激发到高的能量状态(激发态)，与此同时一个不同波长的环形损耗光斑聚焦叠加到前面的那束光斑上。这样两者的重叠区域激发态的荧光团会被拉低到最低能级(即基态)，只有中心区域的小区域发出荧光信号，受激点扩展函数(PSF)的有效尺寸比衍射极限PSF来的小，达到提高分辨率的目的。

这些技术上的进步势必极大地推动生命科学的发展。而这些技术之一、由专利号为US5731588的美国专利公开的受激发射损耗显微镜(Stimulated Emission Depletion(STED)microscopy)被誉为最有应用前景的方法。它是从物理上打破衍射光学极限的远场荧光显微技术，对传统物理学观点的极大挑战。从1994年STED理论的提出，经过多年的实验后，直到2000年Hell开发了超高分辨率显微技术，通过三维扫描可以得到100nm以下的超高分辨率三维图像。尽管STED显微技术得到了一定的发展，然而到目前为止STED原理和方法还没有得到广泛的应用，具体表现在：(1)现有的脉冲STED测量系统光路复杂，使用的光学元器件多，包括昂贵的脉冲激光器、复杂的电子控制系统等。(2)对系统的稳定性要求非常高，为了保证分辨率，一般工作2-3个小时需要重新校准。

实现超分辨STED显微成像的关键是如何形成具有超小尺寸的激发光斑和损耗光斑，而STED显微镜的分辨率主要由有效荧光光斑的大小损耗效果决定的。可以通过各种措施改善STED光在焦平面相干形成的损耗光斑的方式来改善STED的照明装置的稳定性。

STED显微成像技术多种多样。例如，中国专利CN211817464U提出了基于切向偏振的超分辨荧光显微装置，虽然获得良好的显微照明效果，但是实现这一效果需要复杂的光路、昂贵的精密仪器，且稳定性也不是很高。中国专利CN103617330A提出了基于超连续产生的宽带激光光源激发的超分辨STED显微成像装置，虽然改进了两激光同步调节的功能，实现良好的显微照明，但整体光路复杂。中国专利CN211910469073.3提出了一种全光纤型超分辨成像方法与装置，该装置利用光涡旋光纤和光栅型光纤光涡旋转换器来得到光涡旋损耗光，实现超分辨成像。中国专利CN109752830A提出了一种全光纤STED超分辨显微照明装置，该装置中光束生成器的高度集成化，使得设备比较灵活稳定，实现了“单点”的全光纤STED超分辨显微照明。