[发明专利]一种从胎盘中获取母体来源间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种从胎盘中获取母体来源间充质干细胞的方法，其特征在于：所述方法包括，

从胎盘距离脐带半径5cm内，且距离胎儿面0.5cm以上的位置处获取胎盘组织；

采用酶消化液对所述胎盘组织进行酶消化处理，然后对酶消化处理的产物进行细胞培养，获得所述母体来源间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：对所述胎盘组织进行酶消化处理之前，先剔除所述胎盘组织中的直接连通到胎儿面的血管或者白色结缔组织。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述酶消化液中含有胶原酶、透明质酸酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶；

优选的，所述酶消化液由胶原酶、透明质酸酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶溶解于PBS溶液中制备而成；

优选的，所述酶消化液中，胶原酶的浓度为质量分数0.3％-0.5％，透明质酸酶的浓度为质量分数0.1％-0.3％，中性蛋白酶的浓度为100-300U/mL，木瓜蛋白酶的浓度为质量分数0.03％-0.09％。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述酶消化处理，具体包括，每克所述胎盘组织至少加入3mL酶消化液，37℃恒温震荡消化至少20分钟；然后，去除酶消化液，再加入新鲜的酶消化液，37℃恒温震荡消化至少40分钟；

优选的，去除酶消化液的方式为，采用孔径50-100μm的细胞筛网将组织块捞出，弃去剩余液体。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：所述方法具体包括以下步骤；

1)取胎盘距离脐带半径5cm内，且距离胎儿面0.5cm以上的胎盘组织，并剔除所取胎盘组织中的直接连通到胎儿面的血管或者白色结缔组织；

2)采用生理盐水清洗去除步骤1)获得的胎盘组织中的血块、毛细血管组织；

3)将步骤2)清洗后的胎盘组织剪碎，并采用酶消化液进行酶消化处理；

4)酶消化处理完成后，去除碎块，离心去除上清液；

5)采用干细胞培养基重悬步骤4)离心获得的沉淀，并转移至培养瓶中进行培养；

6)采用胰酶消化步骤5)的培养产物，消化下来的细胞即所述母体来源间充质干细胞。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤4)中，去除碎块，具体包括，采用孔径50-100μm的细胞筛网将组织块捞出，然后对液体进行离心，收集沉淀细胞；

优选的，步骤4)还包括，对捞出的组织块进行步骤3)的酶消化处理，然后再将混合物过孔径50-100μm的细胞筛网，对滤液进行离心，收集沉淀细胞。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤5)中，重悬步骤4)离心沉淀产物加入的干细胞培养基量为，每克胎盘组织对应加入至少10mL干细胞培养基。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤5)中，转移至培养瓶中进行培养，具体包括，在37℃、5％浓度CO₂的条件下恒温培养24-48小时，然后弃去上清液和残留组织，再加入新鲜干细胞培养基，在相同条件下继续培养至细胞汇合度达到80％-90％。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：还包括在步骤6)之前，采用生理盐水对步骤5)的培养产物进行至少一次清洗，然后再进行胰酶消化。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：步骤6)中，采用胰酶消化步骤5)的培养产物，具体包括，向步骤5)的培养产物中加入胰酶，室温消化至少2min；然后加入三倍胰酶体积的干细胞培养基，终止消化；混合物离心，弃上清液，获得细胞沉淀；采用生理盐水重悬细胞沉淀，然后再离心弃上清液；采用干细胞培养基重悬，即获得所述母体来源间充质干细胞。