[发明专利]提取小鼠颅骨破骨前体细胞的技术方法

权利要求书

1.一种提取小鼠颅骨破骨前体细胞的技术方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)小鼠颅骨的解剖和处理；

2)将抽取培养基的注射器的针头针尖刺入小鼠颅骨骨髓腔，将骨髓从颅骨内外板间冲出；

3)根据体式显微镜下观察到的小鼠颅骨骨髓位置，不断变换冲洗方向和穿刺位置，或沿骨髓分布移动针头，边移动边冲洗；

4)对破骨前体细胞进行分离、提取；

5)破骨前体细胞诱导分化为破骨细胞的染色和鉴定；

所述步骤1)中小鼠颅骨取自6-8周龄雄性或雌性小鼠；

所述步骤1)中的小鼠颅骨解剖和处理如下：

有菌环境下解剖出小鼠颅骨，转至无菌环境；剥离颅骨内、外板表面骨膜，用含100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的磷酸盐缓冲溶液反复冲洗小鼠颅骨，将圆顶形的小鼠颅骨沿人字缝剪开，将立体结构转化为平面结构；

所述步骤2)具体为：将抽取培养基的10ml无菌注射器换上5号或6号针头后刺入小鼠颅骨外板，保持其内板的完整；将针头斜面对准骨髓腔，将骨髓冲出；

所述步骤2)中抽取的培养基组分为：90％体积比的培养基+10％体积比的胎牛血清+100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素；

所述步骤3)中不断变换冲洗方向和穿刺位置，具体为：

将吸取了培养基的注射器针头的针尖，对准小鼠颅骨中肉眼可分辨及不可分辨的骨髓分布部位，分次刺入小鼠颅骨的骨髓腔进行加压冲洗；

所述步骤3)中的沿骨髓分布移动针头，边移动边冲洗，具体为：

在剪裁好的小鼠颅骨剪切暴露部分的骨髓区域和注射器针头针尖刺入小鼠颅骨骨髓腔后进行，反复冲洗多次，直至颅骨骨片变白；

所述步骤4)中破骨前体细胞的分离、提取，具体为：

将收集的小鼠颅骨骨髓悬液吹打混匀后；用70um孔径的细胞过滤器过滤，1000rmp离心5分钟，用含10％体积比的胎牛血清、100U/ml青霉素+100ug/ml链霉素、30ng/ml巨噬细胞集落刺激因子和20ng/ml核因子κ-配体的α-MEM培养基重悬破骨前体细胞后接种于96孔塑料孔板中，于37℃、5％CO₂培育箱静置培育6天，每2天换一次液，直至破骨细胞形成；

所述步骤5)具体为，破骨前体细胞诱导培养6天后，镜下观察到明显的多核融合的破骨细胞后，行抗酒石酸酸性磷酸酶染色，二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐复染细胞核，显微镜下观察并计数、拍照。