[发明专利]D型流感病毒荧光定量PCR与LAMP荧光定量PCR引物对及其应用

说明书

本发明属于D型流感病毒检测技术领域，具体涉及D型流感病毒荧光定量PCR与LAMP荧光定量PCR引物对及其应用。D型流感病毒主要感染动物中包括猪和牛，对畜牧业的发展具有一定的威胁，提供稳定可靠的检测方法具有重要的意义。本发明提供了一种用于D型流感病毒实时荧光定量PCR检测的引物序列及相应的试剂盒，该引物针对D型流感病毒HE基因中的保守序列进行设计，能够实现良好的检测特异性和灵敏度，敏感性比普通PCR和荧光定量LAMP均高100倍，可以实现大量通用样品的检测，可对D型流感病毒进行快速、高敏感度的实时荧光定量PCR检测，对于提高D型流感病毒的检测精度具有重要的意义。

技术领域

本发明属于D型流感病毒检测技术领域，具体涉及一种用于荧光定量PCR检测D型流感病毒的引物及包含所述引物的检测试剂盒。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

流感病毒是一种单股负链RNA病毒，属于正黏病毒科。以往，根据病毒M蛋白和NP蛋白的不同，流感病毒被分为A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)、B型流感病毒(Influenza B virus，IBV)和C型流感病毒(Influenza C virus，ICV)三种流感病毒，其中A型流感病毒又被分为18种HA亚型和11种NA亚型。

2011年，有学者首次从猪体内分离到一种与C型流感病毒在结构以及基因组成上都相似的流感病毒。随后几年，研究者们陆续从多种动物体内发现该病毒存在的病毒学或血清学证据，并且发现这种病毒的抗体与A型流感病毒、B型流感病毒和C型流感病毒的抗体均无交叉反应性。2016年，国际病毒分类委员会执委会批准将该病毒命名为D型流感病毒(Influenza D virus,IDV)。目前已证明牛是D型流感病毒的自然宿主。通过以雪貂、豚鼠等动物为模型开展的动物实验，研究者们发现D型流感病毒可以通过接触传播的方式在兽群中传播，但空气传播能力有限。由于D型流感病毒可以感染两种重要牲畜—猪和牛，并引起呼吸系统疾病，对畜牧业的健康发展构成潜在威胁，因此加强对兽群中D型流感病毒流行情况的监测对制定合理的防控该病的策略至关重要。

建立建立特异、灵敏、快速的检测方法，对开展兽群D型流感病毒监测工作来说是必须的。荧光定量PCR检测方法符合这一要求。目前研究表明，D型流感病毒的病毒基因组与C型流感病毒相同，均包括PB2、PB1、P3、HE、NP、M和NS基因，然而HE基因作为D型流感病毒的唯一抗原基因，与C型流感病毒的抗原基因HE基因序列相似性仅为50％左右，因此HE基因不同是区分C型流感病毒和D型流感病毒的主要标志之一。近年来的研究表明，C型流感病毒也可感染猪和牛等家畜，而C型流感病毒基因组组成又与D型流感病毒相同，因此在检测兽群中的D型流感病毒时可能会误检C型流感病毒，出现假阳性的结果，影响检测结果。

发明内容

针对上述研究背景，本发明中选择D型流感病毒和C型流感病毒的主要差异基因HE基因作为靶基因来设计荧光定量检测引物，获得了一种特异性强、灵敏度高以及重复性好的检测D型流感病毒的荧光定量PCR引物对。基于该引物对建立的实时荧光定量PCR检测方法，具有良好的检测特异性及灵敏度，检测灵敏度可达到6～7个拷贝。

基于上述研究结果，本发明提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供一对序列，所述序列对如下：

5’-AACAGAGTGGCAGCATACA-3’(SEQ ID No.1)和

5’-TACCCTCCATCAGTGTCG-3’(SEQ ID No.2)。

本发明第二方面，提供第一方面所述序列对作为D型流感病毒检测引物的应用。

优选的，所述检测为荧光定量PCR检测。