[发明专利]蛋白质样品浓度测定方式选择法及测定方法

说明书

本公开涉及一种蛋白质样品浓度测定方式选择法及测定方法，具体公开了一种选择蛋白质样品测定方式及参数的方法，以及采用所选测定方式及参数测定所述蛋白质样品中蛋白质浓度的方法。本公开的方法改善了蛋白质样品浓度测定过程繁琐、耗时费力的现状，同时对仪器参数设置进行优化，解决了高浓度、高消光系数蛋白质样品测定结果与理论值有较大偏差的问题。

技术领域

本公开涉及生物分析领域，具体涉及一种快速准确的测定蛋白质样品浓度的方法，尤其是测定高浓度、高消光系数蛋白质样品浓度的方法。

背景技术

在生物分析领域，蛋白质样品的浓度测定多采用传统的紫外分光光度法(UV)，其测定原理基于朗伯-比尔定律(Lambert-Beer Law)：A＝Ecl，式中A为吸光度，E为摩尔消光系数(与吸收物质的性质和入射光的波长λ有关)，c为吸光物质浓度(单位：mol/L)，l为透光液层厚度(单位：cm)。一般来说，当吸光度在0.3～0.7之间时，仪器具有较小的测定误差和较高的灵敏度。

然而，朗伯-比尔定律必须满足以下适用条件：a.入射光为单色平行光；b.吸收发生在均匀介质中；c.吸收物质及溶剂无相互作用。因此，在实际应用当中，偏离朗伯-比尔定律的情况很多，往往吸光物质浓度越高，测量误差越大，且绝大多数是向下偏离。

目前，对于浓度较高的蛋白质样品，多采用称重稀释法来获得较低浓度的样品，且需测定稀释前后样品溶液的密度来计算稀释倍数。这些过程繁琐，且易引入称量和稀释操作过程中的人为误差。这对于需要对蛋白质样品浓度进行精确计量的领域或过程，例如生物制药产品研发过程和质量控制体系，都造成了潜在风险。

可变光程分光光度法是光程可发生变化的分光光度测定方法。例如，其光程长度可为0.005mm～15mm。该领域中世界首台可变光程的UV-Vis分光光度计是SoloVPE系统，由CTechnologies,Inc提供。该仪器可为斜率光谱系统，其将光纤技术与传统的光谱技术相结合。光纤耦合器捕获来自Agilent Cary 60紫外分光光度计的光束，并将其带入光纤(Fibrette^TM)，光纤插入样品溶液使光束进入样品并到达样品池下方的检测器。光纤可相对样品池底部上下移动以精确控制光程的变化。该系统可通过变换不同的光程测得对应的吸光度，以吸光度对光程作图并进行线性回归分析，可得线性方程：A＝ml+b，其中A为吸光度，m为斜率，l为光程，b为截距。根据朗伯-比尔定律，A＝Ecl，经变换后即为：A/l＝Ec＝m，在已知消光系数E的条件下，即可根据公式c＝m/E求出浓度c。

以SoloVPE为例，与传统的UV法相比，可变光程技术有着如下显著区别：

(1)SoloVPE的光程变化范围为0.005～15.000mm，而传统UV法为10mm；

(2)SoloVPE可设置多个光程，而传统UV的光程固定；

(3)SoloVPE测定无需稀释即可直接测定，传统UV法需通过称重稀释法将其稀释至合适的范围；

(4)SoloVPE一般情况下无需背景校正，而传统UV法需要。

由于SoloVPE不涉及天平称量、密度测定等繁琐操作，其尤其对于GMP实验室大大节省了人力和时间，具有高效率和高通量的显著优势，深受分析人员的青睐。

目前绝大部分关于SoloVPE的文献均突出SoloVPE测定快速、准确度高、精密度好等优点，认为其可以完全替代传统UV。然而，申请人在实际应用和研究中发现，事实上SoloVPE在实际应用中存在一定的限制。