[发明专利]一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法

说明书

本发明公开了一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法，包括以下步骤：提取患者原代蜕膜淋巴细胞；将所获得的蜕膜淋巴细胞进行分选，获得蜕膜NK细胞；将获得的蜕膜NK细胞在含有100ng/ml IL‑15的RPMI‑1640培养基中培养三天，第三天晚上加入细胞内刺激因子；第四天收集蜕膜NK细胞，并用CD3、CD56、IFN‑γ、VEGFα的流式抗体将其染色；在流式细胞分析仪上圈出CD3^—CD56⁺的细胞群体，分析该细胞群中IFN‑γ、VEGFα的表达。本发明检测方法操作简便快捷；圈定的细胞群里可以明确是蜕膜NK细胞，避免了其他细胞对实验结果的影响；而且还可以同时进行多种细胞因子的测定，速度更快，精度更高。

技术领域

本发明具体涉及一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法。

背景技术

正常妊娠期间，母体免疫系统在母胎界面会做出一系列免疫调节机制，从而使母体对类半异体同种移植物的胎儿产生免疫耐受，但若是母胎界面免疫调节功能失衡，则会发生自然流产。与同一配偶连续发生2次或2次以上的自然流产者称为复发性流产(RSA)，RSA严重影响育龄女性的身心健康。近年来，自发流产的发生率在人群中呈现上升趋势。RSA的病因则是多种多样的，包括：生殖道解剖异常、配偶的染色体异常、母体血栓形成障碍、母体免疫功能异常以及各种内分泌紊乱等。然而，仍有40％-50％的RSA患者找不到明显的原因，称为不明原因的复发性流产(uRSA)。

文献报道显示，在这类患者中，绝大多数都存在蜕膜NK细胞分泌功能下降的情况。蜕膜NK细胞是早期妊娠蜕膜中的优势淋巴细胞，在孕早期其比例最多可占到所有蜕膜淋巴细胞的70％。与外周血中的NK细胞不同，蜕膜NK细胞的主要功能就是分泌因子，以达到促进血管新生、胚胎生长的效果。

之前文献报道的衡量蜕膜NK细胞分泌功能的方法主要是qPCR法测蜕膜NK细胞分泌因子基因表达和ELISA法测蜕膜NK细胞上清分泌因子含量。

但是qPCR法原理是在PCR反应体系中，将荧光染料特异性地掺入DNA双链与双链DNA结合后，发射荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不会发射任何荧光信号。从而保证与PCR产物的增加完全同步。但是，由于荧光染料可与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的准确性。qPCR法具有以下缺点：1.实验容易产生假阳性；2.对引物特异性要求较高；3.灵敏度相对较低；4.在提取蜕膜NK细胞DNA时不能避免其他细胞DNA的污染。

ELISA法原理是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，再进行定量测定。但其缺点也是相当明显的：1.ELSA实验步骤繁多，从而造成干扰因素众多，实验重复性不好；2.ELISA众多步骤均需要手工操作，并且一次实验仅能测一种因子的表达量，费事费力；3.在收集蜕膜NK细胞上清时不能避免其他细胞分泌的细胞因子的混杂。

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种评估蜕膜NK细胞分泌功能的方法，包括以下步骤：

1)提取患者原代蜕膜淋巴细胞；

2)将所获得的蜕膜淋巴细胞进行分选，获得蜕膜NK细胞；

3)将获得的蜕膜NK细胞在含有100ng/ml IL-15的RPMI-1640培养基中培养三天，第三天晚上加入细胞内刺激因子；

4)第四天收集蜕膜NK细胞，并用CD3、CD56、IFN-γ、VEGFα的流式抗体将其染色；

5)在流式细胞分析仪上圈出CD3—CD56⁺的细胞群体，分析该细胞群中IFN-γ、VEGFα的表达。