[发明专利]一种增强NK细胞对肿瘤细胞靶向杀伤力的培养方法

权利要求书

1.一种增强NK细胞对肿瘤细胞靶向杀伤力的培养方法，所述方法包括：

（1）纳米材料制备：将介孔二氧化硅负载细胞因子后用透明质酸封闭孔道，再吸附CD16/ TLS11a双特异性核酸适配体，得到双特异性核酸适体修饰的纳米材料；

所述CD16 / TLS11a双特异性核酸适配体由Apt-CD16和TLS11a两条脱氧核酸链构成；

Apt-CD16的序列如下：

5’-GG CCA TGT GTA TGT GGG CCA CTG CGG GGG TCT ATA CGT GAG GAA GAA GTG GGCAGG TCC CCA CAT ACT TTG TTG ATC CTA CCG TCG TT-3’

TLS11a的序列如下：

5’- CGA CGG TA GGA TCA ATC ATG GCC AGC ATC CCC ATG TGA ACA ATC GCA TTGTGA TTG TTA CGG TTT CCG CCT CAT GGA CGT GCT G-3’

（2）NK细胞激活：PBMC细胞重悬于NK细胞激活培养基中，加入辐射的工程化IL-21 K562细胞共培养，培养过程中每天根据细胞数量添加培养液和细胞因子，培养12~14天收集获得激活的NK细胞；所述NK细胞激活培养基组成如下：庆大霉素10~200 IU/mL，重组人IL-2 50~1000 IU/mL，自体血浆1%~5%，溶剂为KBM581无血清培养基；所述细胞因子为下列之一：重组人白细胞介素2、重组人白细胞介素7、重组人白细胞介素12、重组人白细胞介素15、重组人白细胞介素21；

（3）共培养：将激活的NK细胞与双特异性核酸适体修饰的纳米材料共培养30~60min。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述细胞因子为重组人白细胞介素21。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（1）所述双特异性核酸适配体按如下方法制得：将Apt-CD16与TLS11a以1:1物质的量之比混合，在95 ℃加热反应5 min后，缓慢降至室温，置于4℃冰箱过夜，得到所述双特异性核酸适配体。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤（1）方法如下：将0.1mg的介孔硅材料离心去除上清，加入0.2mL的0.1 ~ 1 mg/mL细胞因子，室温搅拌30 min后，离心去除上清，加入2~5倍质量的透明质酸反应1h，得到介孔复合物；将双特异性核酸适体与所得介孔复合物共孵育12h，离心去除上清，得到双特异性核酸适体修饰的纳米材料。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（2）所述PBMC细胞按如下方法获得：将全血与生理盐水等体积混合，将混合液缓慢加入到Ficoll上层且不破坏液层界面，解除离心机的加速和刹车机制，800G离心20 min，收集中间层云雾状的PBMC细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤（3）中1.5 × 10⁶个激活的NK细胞与10 ng~ 200 ng 的纳米材料共培养。