[发明专利]一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法

说明书

一种维生素D3羟化酶转化生产25‑羟基维生素D3的方法，该方法按如下步骤进行：a.发酵：将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入发酵培养基，培养至OD600＝1‑5时加入IPTG进行诱导产酶，其中IPTG的终浓度为1.2‑2mM，诱导温度为28℃，发酵培养16‑24h得发酵液；b.破壁：发酵液通过11000‑13000rpm离心5‑7min，收集菌体，并加入发酵液体积4‑6倍的去离子水洗菌体1‑3次，用磷酸与硝酸1.5:1混合缓冲液重悬菌体，菌液通过高压均质机进行机械破壁，获得细胞破壁液；等步骤从流程上缩短转化周期，在短时间内直接引入羟基生成活性产物，该转化条件温和。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法。

背景技术

骨化二醇，又称为25-羟基维生素D3[25(OH)VD3]，是维生素D3的一种生物活性衍生物，维生素D3在人体内没有活性，必须通过生物酶转化成有活性的生物成分才能发挥作用。动物实验表明，骨化二醇对骨质疏松症、佝偻病、骨软化症等代谢性骨病有明显效果，同时还可用于治疗血液透析所致的低血钙症。还可作为保健食品原料及饲料添加剂使用，在保健食品，医药领域及饲料添加剂等方面有着广泛的应用。

25-羟基维生素D3[25(OH)VD3]可以利用化学法合成，但多数化学合成所用到的方法均是径开环、断键、环和、还原、耦合、氧化、纯化等多步骤反应，其化学合成法存在反应步骤多、转化率低、且分离纯化过程复杂等缺点，不利于大规模的工业化生产。近年来，随着产酶菌株的筛选及基因工程菌的开发，使微生物转化维生素D3生产骨化二醇成为研究热点，微生物转化法生产骨化二醇具有生产成本低，反应特异性高，反应条件温和，环境友好等优点，是未来生产骨化二醇的研究重点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。简化流程、节约时间、短时间内直接引入羟基生成活性产物，游离酶催化效果好。

本发明的目的是通过下述技术方案予以实现：一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，该方法按如下步骤进行：

a.发酵：将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入发酵培养基，培养至OD600＝1-5时加入IPTG进行诱导产酶，其中IPTG的终浓度为1.2-2mM，诱导温度为28℃，发酵培养16-24h得发酵液；

b.破壁：发酵液通过11000-13000rpm离心5-7min，收集菌体，并加入发酵液体积4-6倍的去离子水洗菌体1-3次，用磷酸与硝酸1.5:1混合缓冲液重悬菌体，菌液通过高压均质机进行机械破壁，获得细胞破壁液；

c.粗提：将b步骤获得的破壁液6000-12000rpm离心处理1-10min，收集上清液，获得维生素D3羟化酶一次酶液；

d.底物配置：采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，过滤底物，放置冷藏箱冷藏4h，将环糊精与底物融合预埋，摇匀培养3d；

e.转化：底物配置采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，缓慢加入到c步骤获得的二次酶液中，同时加入0.1％-0.5％的维生素D3羟化酶的辅因子，在400-700rpm震荡条件下进行游离酶转化；

f.将步骤e转化后，进行减压浓缩，收集有机溶剂，对浓缩液进行高温或者低温结晶处理，得到25-羟基维生素D3晶体物质。

进一步地，所述a步骤产维生素D3羟化酶的基因工程菌为放线菌或是大肠杆菌。

进一步地，所述a步骤的发酵培养基主要成分及其含量为:蛋白胨1％，麦芽糖1.5％、酵母提取物0.6％，NaCl 0.2％、0.005％NaF，pH至7.0,转化温度30度。