[发明专利]一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法

权利要求书

1.一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，该方法按如下步骤进行：

a.发酵：将产维生素D3羟化酶的基因工程菌接入发酵培养基，培养至OD600＝1-5时加入IPTG进行诱导产酶，其中IPTG的终浓度为1.2-2mM，诱导温度为28℃，发酵培养16-24h得发酵液；

b.破壁：发酵液通过11000-13000rpm离心5-7min，收集菌体，并加入发酵液体积4-6倍的去离子水洗菌体1-3次，用磷酸与硝酸1.5:1混合缓冲液重悬菌体，菌液通过高压均质机进行机械破壁，获得细胞破壁液；

c.粗提：将b步骤获得的破壁液6000-12000rpm离心处理4-10min，收集上清液，获得维生素D3羟化酶一次酶液；

d.底物配置：采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，过滤底物，放置冷藏箱冷藏4h，将环糊精与底物融合预埋，摇匀培养3d；

e.转化：底物配置采用有机溶剂溶解维生素D3，摇匀，缓慢加入到c步骤获得的二次酶液中，同时加入0.1％-0.5％的维生素D3羟化酶的辅因子，在400-700rpm震荡条件下进行游离酶转化；

f.结晶：将步骤e转化后，进行减压浓缩，收集有机溶剂，对浓缩液进行高温或者低温结晶处理，得到25-羟基维生素D3晶体物质。

2.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，所述a步骤的产维生素D3羟化酶的基因工程菌为放线菌或是大肠杆菌。

3.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，所述a步骤的发酵培养基主要成分及其含量为:蛋白胨1％，麦芽糖1.5％、酵母提取物0.6％，NaCl 0.2％、0.005％NaF，pH至7.0,转化温度30度。

4.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，所述b步骤的磷酸与硝酸1.5:1混合缓冲液为发酵液体积30-45％的0.4mol/L磷酸与硝酸缓冲液(pH5.8)。

5.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，所述b步骤的高压均质机破壁条件为800-1500bar的压力下处理15-40min。

6.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，所述d步骤的有机溶剂包括无水乙醇、吐温、乙酸乙酯、己酸乙酯、乙醚中的任意一种或两种的组合，有机溶剂中维生素D3的浓度为25-30％。

7.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，所述b步骤的发酵液破壁前加入丙酮置于离心管中加入适量乙酸乙酯，摇匀然后在13000r/min，离心7-10min。

8.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，所述步骤c的维生素D3在一次酶液为酶液，其中的终浓度控制为0.2-5g/L。

9.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，所述步骤e的维生素D3羟化酶的辅因子为NAD+和NADP+、细胞色素C、铜盐和铁盐、钙离子中的一种。

10.根据权利要求1所述的一种维生素D3羟化酶转化生产25-羟基维生素D3的方法，其特征在于，所述d步骤的转化温度为30-45℃、转化周期为24-48h。