[发明专利]一种生产角蛋白酶的方法

说明书

本发明公开了一种生产角蛋白酶的方法，属于微生物和发酵技术领域。本发明通过从发酵培养基成分(碳源、氮源、金属离子、磷酸盐)和发酵条件(温度、pH、接种量)两个方面入手，对利用枯草芽孢杆菌发酵生产角蛋白酶的工艺进行了优化。利用本发明的方法发酵生产角蛋白酶，可使得角蛋白酶的产量较对照提高3.3倍，在3L发酵罐产酶，酶活达到704400U/mL。因而本发明的方法在饲料、制革等方面角蛋白酶的制备中有着广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种生产角蛋白酶的方法，属于微生物和发酵技术领域。

背景技术

角蛋白酶是一种可以特异性降解角蛋白类底物的蛋白酶。产角蛋白酶的微生物主要为细菌、真菌、放线菌。目前，针对角蛋白酶发酵优化的研究，主要集中在野生菌的筛选、发酵培养基成分优化和发酵条件优化，在产角蛋白酶菌株资源的挖掘中，最常见的是细菌，具有发酵周期短、酶活高、生产安全性好等特点，角蛋白酶在饲料、肥料、洗涤剂、皮革、纺织、化妆品行业和医疗等领域具有很好的应用前景。随着人们对角蛋白酶的催化性质在工业应用潜力认识的不断加深，野生菌所产角蛋白酶的性能和产量远远不能满足市场需求。目前筛选得到的产角蛋白酶野生菌大多集中在枯草杆菌属，其胞外分泌的酶种类多，底物作用专一性差，而且产酶不稳定，不利于工业化生产。近年来越来越多的角蛋白酶基因得到克隆和异源表达，采用基因工程菌，强化基因转录和翻译，达到高效表达和活性分泌，可以有效提高角蛋白酶的生产强度。基因工程菌和重组角蛋白酶经过性能改造，胞外分泌酶单一，简化了发酵下游的纯化工作。然而，高生产成本和低产量限制了角蛋白酶的工业化生产，因此通过发酵优化技术手段来提高产量降低成本。

发明内容

为了解决角蛋白酶生产菌株发酵酶活低，发酵成本过高的问题。本发明的方法从发酵培养基成分(碳源、氮源、金属离子、磷酸盐)和发酵条件(温度、pH、接种量)两个方面入手，对利用枯草芽孢杆菌发酵生产角蛋白酶的工艺进行了进一步优化；利用本发明的方法发酵生产角蛋白酶，可使得角蛋白酶的产量得到提升，在饲料、制革等方面有着广阔的应用前景。

本发明对发酵培养基进行优化。首先利用单因素试验对培养基成分和培养条件进行了优化；然后设计Plackett-Burman试验筛选得到三个显著因素：酵母浸膏、pH、温度；最后设计Box-Behnken中心组合试验并进行响应面分析。获得最佳工艺进行验证以及高密度发酵。

本发明提供了一种培养基，所述培养基的组分为蔗糖、豆粕、酵母浸膏、Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄和MgSO₄·7H₂O。

在本发明的一种实施方式中，所述蔗糖的含量为20～40g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述豆粕的含量为35～45g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述酵母浸膏的含量为5～10g/L或25～30g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述Na₂HPO₄·12H₂O的含量为2～20g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述KH₂PO₄的含量为1～10g/L。

在本发明的一种实施方式中，所述MgSO₄·7H₂O的含量为0.1～1.0g/L。

本发明提供了一种提高角蛋白酶产量的方法，所述方法是将角蛋白酶发酵菌株接种至所述培养基中产酶。

在本发明的一种实施方式中，所述角蛋白酶发酵菌株的接种量为发酵培养基的4～7％(v/v)，接种时菌液的OD₆₀₀为0.6～1.0。