[发明专利]农杆菌介导的炭角菌科真菌sj18转化子菌株及其制备方法和应用

权利要求书

1.农杆菌介导的炭角菌科真菌sj18转化子菌株，其特征在于：在制备该转化子菌株时，农杆菌感染受体为sj18菌株，其保藏号为CGMCC No.12780。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的炭角菌科真菌sj18转化子菌株，其特征在于：农杆菌采用农杆菌菌株AGL-1、农杆菌菌株GV3101或农杆菌菌株EHA105。

3.采用pPK2表达载体，启动子采用来自构巢曲霉gpda启动子和hsp70启动子中的一种或两种，功能基因为eGFP或sGFP报告基因。

4.根据权利要求3所述的农杆菌介导的炭角菌科真菌sj18转化子菌株，其特征在于：pPK2表达载体eGFP或sGFP报告基因的前端留有单酶切位点可供其它功能基因后续接入，接入后形成融合蛋白，方便转化子筛选和功能研究。

5.一种权利要求1所述的农杆菌介导的炭角菌科真菌sj18转化子菌株的制备方法，其特征在于该方法包括以下几个主要步骤：

(1)真菌表达载体的制备；

(2)农杆菌感受态的制备；

(3)待转化真菌的准备；

(4)农杆菌介导的梯度转化；

(5)目的菌株的多层次筛选。

6..根据权利要求5所述的炭角菌科真菌sj18转化子菌株的制备方法，其特征在于步骤(1)包括以下主要两个步骤：

①通过PCR方法用高保真酶从其它质粒中获得带有酶切位点的gpdA或hsp70启动子序列、eGFP或sGFP基因、以及终止子trpc片段，进行酶切并接入到T载体中；

②以pPK2载体为骨架，通过Infusion的同源重组方法插入各种目的片段，来构建所需表达载体。

7.根据权利要求5所述的炭角菌科真菌sj18转化子菌株的制备方法，其特征在于步骤(3)包括以下步骤：

①sj18菌株在PDA培养基平板上20-34℃活化3-7天；

活化后，打孔或刮取健壮菌丝块加入PDB液体培养基中，按100ml培养基接入一块0.5cm左右菌丝块的比例，同时加入2-5mm直径的玻璃珠3-5颗，在32℃150rpm振荡培养3-4天，打散成团的菌丝，方便后续涂布；

③将获得的打散后的sj18菌进行梯度稀释涂板培养，并根据菌落统计，控制稀释后菌的生长密度达106CFU左右，0-4℃冰箱冷藏备用。

8.根据权利要求5所述的炭角菌科真菌sj18转化子菌株的制备方法，其特征在于步骤(4)包括以下步骤：

从冰箱中取出农杆菌感受态细胞悬液1000μl、sJ18菌株待转化菌悬液1000μl，冰浴；

将农杆菌用PDB培养基稀释至OD600值0.3，加入AS诱导剂至终浓度为200-300μM，30℃、600rpm诱导培养，诱导至OD600值在0.6-0.8之间；

③sj18菌株稀释100倍后，4℃、4000g离心5分钟，去掉上清，加入诱导好的农杆菌悬液混匀，为克服sj18菌液不均一的影响，通常将sj18菌液分成从10：1到1：10内的4个浓度比例；

混匀后的菌悬液先25℃振荡培养2-3h，同时准备加有200-300μM 诱导剂AS的PDA平板，并在PDA平板上铺上0.45μm的微孔滤膜，然后将菌体均匀涂在微孔滤膜上，25℃培养箱黑暗培养2天。