[发明专利]流感病毒荧光定量PCR检测方法

权利要求书

1.一种流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括：

将免疫磁珠和DEAE磁珠混合得到病毒核酸提取磁珠；

使用所得的病毒核酸提取磁珠提取待检样本中的病毒核酸；

采用Taqman探针与荧光定量PCR技术相结合的高分辨溶解曲线法对提取得到的病毒核酸进行荧光定量PCR扩增，从而实现待检样本中流感病毒的分型检测。

2.如权利要求1所述的流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的免疫磁珠包被有抗甲型流感病毒抗体和抗乙型流感病毒抗体。

3.如权利要求1所述的流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增所采用的引物和探针为根据流感病毒的基质蛋白M基因和血凝素HA基因分别设计，其中包括甲型流感病毒H1N1和H3N2以及乙型流感病毒Victoria lineage 2008和Yamagatalineage，分别用不同的荧光基团偶联，在不同的信道检测。

4.如权利要求3所述的流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述引物和探针的序列如下：

上游引物甲型流感H1-F：5’-GAGCTAAGAGAGCAATTGA-3’

下游引物甲型流感H1-R：5’-GTAGATGGATGGTGAATG-3’

探针甲型流感H1 P：5’-Fam-TTGCTGAGCTTTGGGTATGA-3'-BHQ-1

上游引物甲型流感N1-F：5’-TCCACGCCCTAATGATAA-3’

下游引物甲型流感N1-R：5’-TTCTCCCTATCCAAACAC-3’

探针甲型流感N1 P：5’-Fam-ATCCTTTTACTCCATTTGCTCC-3'BHQ-1

上游引物甲型流感H3-F：5’-AGCAAAGCCTACAGCAA-3’

下游引物甲型流感H3-R：5’-GACCTAAGGGAGGCATAA-3’

探针甲型流感H3 P：5'-Texas Red-CCGGCACATCATAAGGGTAACA3'-BHQ-2

上游引物甲型流感N2-F：5’-GTCCAACCCTAAGTCCAA-3’

下游引物甲型流感N2-R：5’-GCCACAAAACACAACAATAC-3’

探针甲型流感N2 P：5'-Texas Red-CTTCCCCTTATCAACTCCACA-3'-BHQ-2

上游引物乙型流感V-F：5’-AGACCAGAGGGAAACTATGCCC-3’

下游引物乙型流感V-R：5’-TCCGGATGTAACAGGTCTGACTT-3’

探针乙型流感V P：5’-Cy5-CAGACCAAAATGCACGGGGAAHATACC-3’-BHQ-3

上游引物乙型流感Y-F：5’-AGACCAGAGGGAAACTATGCCC-3’

下游引物乙型流感Y-R：5’-TCCGGATGTAACAGGTCTGACTT-3’

探针乙型流感Y P：5’-Cy5-CAGRCCAATGTGTGTGGGGAYCACACC-3’-BHQ3。

5.如权利要求1所述的流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的免疫磁珠的制备包括如下步骤：称取含有羧基基团的二氧化硅磁珠，然后依次加入EDC和NHS，避光搅拌反应，形成活化酯磁珠；

取抗甲型流感病毒抗体或抗乙型流感病毒抗溶于PBS中，将上述活化酯磁珠缓慢滴加到抗流感病毒抗体溶液中，4℃搅拌反应过夜，得到甲型流感病毒抗体的免疫磁珠或乙型流感病毒抗体的免疫磁珠，保存备用。

6.如权利要求5所述的流感病毒荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的DEAE磁珠的制备包括如下步骤，称取含有羧基基团的二氧化硅磁珠，然后依次加入EDC和NHS，室温避光搅拌反应，形成活化酯磁珠；

取DEAE溶于PBS中，将上述活化酯磁珠缓慢滴加到DEAE溶液中，4℃搅拌反应过夜，即得DEAE磁珠，保存备用。