[发明专利]用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶

说明书

本发明涉及用于生产乙酰氨基葡萄糖的高效几丁质酶，酶氨基酸序列(Chitinolytic bacter meiyuanensis,GenBank:ATN39892.1)在第266位、第270位、第342位上发生突变，由原来的T、Y、K分别突变为S、I、M，其有意效果在于，改进的几丁质酶生产乙酰氨基葡萄糖的酶活较野生型酶提高10.07‑34.90％。

技术领域

本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及乙酰氨基葡萄糖生产用高效几丁质酶的制备。

背景技术

几丁质(chitin)也称为甲壳质，是一种由N-乙酰-D-氨基葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的直链高分子生物多聚体，是含量仅次于纤维素的第二大天然多聚物。几丁质是甲壳类动物、昆虫、真菌及线虫等病原生物体壁结构上的重要组成，对机体具有支持与保护作用。几丁质酶(Chitinase)EC3.2.1.14是BENECKE U在1905年研究几丁质芽孢杆菌分解几丁质的过程中，首次分离发现的，可彻底水解几丁质为N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体或N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)，几丁质酶广泛分布于真菌、细菌及放线菌等，还大量存在于昆虫、甲壳动物、高等植物甚至病毒中。几丁质酶是生物体内降解或利用几丁质的关键，几丁质酶能通过水解病原真菌细胞壁，破坏害虫体壁及杀虫增效等机制发挥生物防治作用，另一方面几丁质酶还能通过催化几丁质水解，促进自然界循环的作用，维持生态系统平衡。几丁质酶催化几丁质水解成N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体或GlcNAc，N-乙酰氨基葡萄糖寡聚体或GlcNAc具有抗菌、调节机体免疫，抑制肿瘤细胞生长，使几丁质酶被大量用于环境保护、医药、农业、食品加工等领域并表现出巨大的市场潜力。

继BENECKE U于1905年首次从几丁质芽孢杆菌(Bacillus chitinovrous)中发现并分离微生物几丁质酶后，各国学者陆续发现细菌、放线菌、真菌、甚至病毒等分属46个属近70个种的微生物均能分泌几丁质酶。此外，海洋微生物也蕴藏着巨大的潜力，诸如珊瑚、嗜冷菌(Moritella marina)、海洋链霉菌(Streptomyces olivaceus)、白孢链霉菌(Streptomyces albosporeus)及蜂房芽孢杆菌(Bacillus pluton)等海洋微生物都表现出极强的几丁质酶分泌能力，而芽孢杆菌属(Bacillus sp.)中的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)及枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等更是目前研究运用比较多的几丁质酶来源微生物，Chen J-K等从Aeromonashydrophila H-2330中提取的粗酶从甲壳素生成GlcNAc的产率是77％，Alei Zhang从Chitinolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1中克隆获得了一种新的几丁质酶，具有外作用、内作用和N-乙酰-β-d-葡萄糖胺酶的活性，其对胶体几丁质的活性为15.3U/mg，本研究在其基础上，提高了N-乙酰-β-d-葡萄糖胺酶的活性。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供具有更高活性的几丁质酶。

本发明的制备过程如下：