[发明专利]桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法

说明书

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法，选取桔小实蝇Flightin基因的部分序列SEQ ID NO.1，通过引物设计、flightin基因及对照egfp基因片段的克隆、构建桔小实蝇RNAi干扰表达载体、重组质粒转化大肠杆菌HT115以及dsRNA在大肠杆菌HT115中的表达，获得桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液。本发明采用重组质粒可以在大肠杆菌HT115中表达大量所需的外源目的dsRNA的方法，降低了实验成本，持续饲喂菌液后对桔小实蝇的飞行能力有抑制作用，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法。

背景技术

桔小实蝇是全球具危害性的检疫性果蔬害虫,目前对该害虫的防治手段主要有人工防治、化学防治、性诱剂引诱、生物防治等，这些手段具有一定的防治效果，但总体存在效率低、成本高、对生态环境不友好等问题。

桔小实蝇具有极强的飞行能力，是造成其分布和发生区不断扩张，以及根除后又再次发生的重要原因，超强的飞行能力使得对桔小实蝇的防治变得困难。桔小实蝇具有的飞行蛋白flightin基因是一种大小在20kDa的多磷酸化肌原纤维蛋白，Flightin基因对昆虫肌肉伸展活化具有重要作用，在间接飞行肌的粗肌丝上与肌球蛋白高度融合，调控和指导粗肌丝的准确组装和收缩等。选择飞行蛋白flightin基因作为RNA 干扰靶标，破坏昆虫飞行肌表达通路，阻止昆虫肌肉伸展活化及肌丝的组装和收缩等生理过程，可达到害虫防治的目的。目前，并未有文献记载关于桔小实蝇flightin基因的干扰相关研究。

发明内容

针对目前未见利用RNA干扰技术抑制桔小实蝇飞行行为的研究，本发明提出一种桔小实蝇dsRNA细菌表达菌液的制备及其使用方法。

本发明的桔小实蝇flightin基因的dsRNA细菌表达菌液，其特征在于通过以下步骤获得：

1）引物设计

选取桔小实蝇Flightin基因的部分序列SEQ ID NO.1，结合含有T7聚合酶的L4440干扰载体的多克隆位点以及桔小实蝇flightin基因序列和egfp序列的限制性内切酶位点设计上游和下游引物。上、下游引物的5’端分别加入SacI和XhoI酶切位点，具体为：

flightin-F：5’-CGAGCTCACTCGTATAATGGCTGATG-3’；其中：下划线为SacI酶切位点；

flightin-R：5’-CCTCGAGATAGCGACAAGCTCCCAC-3’；其中：下划线为XhoI酶切位点；

egfp-F：5’-CGAGCTCACGTAAACGGCCACAAGTTC-3’；其中：下划线为SacI酶切位点；

egfp-R：5’-CCTCGAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTG-3’；其中：下划线为XhoI酶切位点；

2）flightin基因及对照egfp基因片段的克隆

以桔小实蝇cDNA和含egfp基因的质粒为模板，通过PCR扩增，PCR扩增体系为TSINGKEMaster Mix DNA Polymerase 12.5μl，上下游引物和模板各1μl，加灭菌ddH₂O至总体积25μl，扩增条件为95℃预变性3min，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，35个循环；最后72℃延伸10min，产物回收，得到含SacI和XhoI酶切位点的桔小实蝇Flightin和egfp基因片段；

3）构建桔小实蝇dsRNA细菌表达载体