[发明专利]基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法

说明书

本发明属于基因突变技术领域，公开了一种基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法，选取一段包含点突变位点的序列作为靶基因；将upstream、IFDC2、downstream片段融合；将融合片段转入变异链球菌中，利用含红霉素的BHI琼脂平板进行阳性克隆筛选及PCR验证；将包含upstream、靶基因、downstream的序列分为前后两部分；将扩增出的mutant‑upstream和mutant‑downstream片段融合；将融合片段mutant up‑down转入获得的阳性克隆菌株中，利用含p‑Cl‑Phe的BHI平板进行二次筛选及测序验证。本发明步骤简便，成本低，可重复性高。

技术领域

本发明属于基因突变技术领域，尤其涉及一种基于密码子偏好性利用点突变抑制变异链球菌毒力的方法。

背景技术

目前，龋病是除冠心病、癌症之后，世界卫生组织列明的三大非传染性慢性病之一。第四次中国口腔健康流行病学调查报告显示，乳牙和年轻恒牙龋病患病水平呈明显上升趋势，防治龋病已成为加强我国人群口腔健康的重点项目。龋病本质是由微生物感染所致的牙体硬组织破坏性疾病，变异链球菌(Streptococcus mutans)是目前公认的主要致龋微生物之一，其致龋毒力机制主要包括对牙面的黏附、利用糖类产生多糖以及较强的产酸和耐酸能力。变异链球菌对牙面的黏附是其定植、致龋的基础，其中葡糖基转移酶(glucosyl transferase，GTF)是当前研究的热点之一。大多数变异链球菌含有至少3种GTF基因，即gtfB、gtfC、gtfD。gtfB编码的GTF-I合成水不溶性葡聚糖(insoluble glucans，IG)，gtfC编码的GTF-SI合成IG和水溶性葡聚糖(soluble glucans，SG)的混合物，gtfD编码的GTF-S合成SG。此外，与变异链球菌黏附素合成相关的表面蛋白P1和P1样蛋白，与产酸性相关的乳酸脱氢酶，与耐酸能性相关的ropA、brpA等毒力因子均是变异链球菌致龋性的重要物质基础。因此，如何通过降低这些毒力因子表达，进而抑制变异链球菌过度生长，减少胞外多糖产生，抑制生物膜形成及产酸耐酸能力，是防治龋病的有效措施。

众所周知，在生物体传递遗传信息的过程中，作为联结核酸和蛋白质的密码子扮演着重要的角色。在遗传密码中，mRNA上3个相邻的碱基组成一个密码子，一个密码子可编码一种氨基酸。在生物体中有61种密码子，20种氨基酸，这是由于遗传密码具有简并性，同一氨基酸对应的多个密码子被称为同义密码子。但这些同义密码子在翻译的过程中使用的频率并非一致，这种现象被称为“密码子偏好性”。密码子偏好性广泛存在于不同生物中，是物种在长期进化过程中受环境选择、碱基突变、基因漂变等因素共同作用的结果，其还受到基因组大小、tRNA丰度和基因表达水平等的影响。密码子偏好性对蛋白的表达有着直接的影响，能通过tRNA在翻译水平上改变蛋白的翻译速度。在同一生物中，携带同一种氨基酸的不同tRNA称为同功受体tRNA，tRNA的浓度通常与其读取的密码子的频率正相关。在高度表达的基因中，编码同种氨基酸的密码子中往往有一个密码子在频率上占主导地位，并且该密码子通常由最丰富的tRNA的同种受体读取。因此，将宿主基因中不同频率的同义密码子进行替换，将影响蛋白翻译水平，进而改变相关的表型。在龋病微生物研究中，尤其是变异链球菌的基因编辑中，该技术仍未见详细报道。

目前，抑制变异链球菌毒力的方法大多是通过外源性地加入某些药物和小分子化合物或通过引入拮抗菌，竞争性地抑制变异链球菌活性。尽管这些方法能在一定程度上抑制变异链球菌毒力，但它们仍有一些缺点：(1)药物筛选具有盲目性，不能高效准确的找到特异性强的药物，且具体作用成分难以确定；(2)某些小分子的提纯或合成成本昂贵，步骤繁琐；(3)药物及化合物作用的具体机制大多尚不清楚，毒副作用也不明确；(4)某些拮抗菌是否对机体具有潜在毒性未见报道等。此外，也有利用传统的基因敲除方法敲除毒力基因，从而达到抑制效果，但将目的基因敲除常常只是破坏部分外显子而不是整个编码区，残留的编码序列可能组合出新的未知的功能，给表型分析带来麻烦；并且，对于某些必须基因，完整敲除后将造成细胞死亡，也就无法研究这些基因的功能。因此，综合以上原因，亟需寻找一种新的策略来弥补当前技术的不足。