[发明专利]一种强免疫调节，强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞和其制备方法与试剂盒

说明书

本发明公开了一种强免疫调节、强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞和其制备方法及制备试剂盒，其采用Transwell培养体系使用间充质干细胞对活化前的NK细胞进行孵育驯化，从而，Transwell培养体系对间充质干细胞与NK细胞共培养，驯化了NK细胞的免疫调节能力。此外，本发明利用CD16单抗联合IFN‑γ、OK432、IL‑2、IL‑21和IL‑15活化培养NK细胞，IL‑2和烟酰胺扩增培养NK细胞，增强了NK细胞的增殖能力和促进NK细胞对肿瘤细胞和病毒感染细胞的杀伤活性。

技术领域

本说明书涉及细胞培养领域，尤其涉及一种强免疫调节，强杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的增强NK细胞和其制备方法、试剂盒。

背景技术

自然杀伤细胞(Natural Killer cell，NK细胞)，是除T细胞、B细胞之外的第三大类淋巴细胞，属于我们人体免疫第一道防线，也是人体免疫细胞大家族中的一个重要成员，常年战斗在保卫人体健康的第一线上，被誉为天然免疫核心细胞。NK细胞不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调解有关，甚至参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。

自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。

NK细胞是一群主要针对肿瘤细胞和病毒感染细胞发挥杀伤活性的免疫细胞，具有无需预先致敏、高效性等特点，在抗肿瘤和抗感染免疫以及调节特异性免疫反应中发挥重要作用。通常认为，NK细胞的功能状态取决于细胞表面一系列活化和抑制性受体信号的平衡，而肿瘤细胞和病毒感染细胞由于失去了NK细胞抑制性受体的配体或过量产生活化性受体的配体而被识别并杀伤。人类主要NK细胞活化性受体包括NKG2D和自然细胞毒性受体(nat—ural cytotoxicity receptors，NCRs)，后者包括NKp46、NKp30和NKp44等。

NK细胞主要分布于外周血、肝脏和脾脏，在人体内NK细胞主要特征为CD3-CD56+淋巴细胞群，其中血液中主要为CD16+CD56dim亚型(根据细胞上CD56分子表达密度的差异，将NK细胞分为CD56dim和CD56bright两个亚群；CD56dim占NK细胞90％以上，主要为细胞毒作用，表达中度亲和力的IL-2受体(IL-2R)，具有更强的杀伤活性；CD56bright可产生大量细胞因子，主要起免疫调节作用，高表达IL-2R)。

IL-2是白细胞介素家族中的重要成员之一，它能促进T细胞增殖，刺激细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的增殖与分化，增强自然杀伤(natural killer，NK)细胞的细胞毒活性。而且，IL-2在生物体内具有显著的抗肿瘤作用。

IFN-γ主要由活化的Th细胞和NK细胞产生，其生物学功能主要是免疫调节，诱导多种抗原提呈细胞表达MHC-I/II分子，活化单核细胞、巨噬细胞并增强溶菌活性及分泌IL-1、TNF-α等。IFN-γ还能活化中性粒细胞、NK细胞，刺激血管内皮细胞和白细胞合成的粘附分子，促进Th1细胞发育和抑制TH2细胞活化与增殖，刺激B细胞产生的抗体类型向调理素方向转变。

OK432制剂是一种作用于肿瘤的药物。是将A群溶血性链球菌(Su株)以苯基尼西林加热处理并冷冻干燥之制剂，具有免疫活性作用。能够与单核细胞等的细胞表面TLR结合，活化单核细胞，激活免疫反应。

间充质干细胞(MSCs)因其独特的免疫调节及其他生物学特性,在组织损伤,免疫调控和再生医学领域受到了广泛的研究,并在临床试验中用于治疗一系列免疫相关的疾病.然而,临床试验结果表明,MSCs既可以抑制免疫应答,也可以促进免疫应答,MSCs具有免疫调节的可塑性。