[发明专利]一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法及基于其检测8-OhdG的方法

说明书

本发明公开了一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法，其利用NiNPs与组氨酸较强的螯合结合力，将一端修饰组氨酸的8‑OHdG适体联接在NiNPs上，形成NiNPs‑组氨酸‑8‑OHdG适体复合物，并将此复合物上适体DNA与磁性微球上捕获探针碱基互补配对从而形成NiNPs适体传感器，制备的传感器灵成品性能稳定、应用效果优异。本发明还公开了利用上述铁氰化镍纳米粒适体传感器化学发光8‑OhdG检测的方法，以8‑OHdG适体上所连接的纳米镍作为检测探针，利用纳米镍催化鲁米诺体系产生化学发光信号的原理，建立适体传感器上所连接的纳米镍的用量与化学发光强度的对应关系，从而得出8‑OHdG浓度与化学发光强度的量化关系，间接实现8‑OHdG的定量分析检测，而且大大提高了检测灵敏度和精密度。

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，进一步涉及核酸适配体技术，具体涉及一种铁氰化镍纳米粒化学发光适体传感器的制备方法及基于其检测8-OHdG的方法。

背景技术

8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)是鸟嘌呤氧化在活性氧物质攻击鸟嘌呤碱基的第八个碳原子的过程中的主要产物。8-OHdG是DNA中自由基诱导的氧化损伤的主要形式之一，是氧化应激的优良生物标志物，是多种疾病的危险因素，包括癌症，糖尿病和神经系统疾病。国际上已经广泛应用于环境污染和职业安全评价、疾病早期诊断、癌症发生机制研究等领域，因此研究8-OHdG检测新方法越来越受到重视，研究一种满足不同层次的快速灵敏性高并且简便的检测方法具有重要意义

8-OHdG通过血液运输并排泄到尿液中而不会进一步代谢。因此，可以通过检测尿液中8-OHdG的浓度判断DNA的氧化损伤浓度。目前，³²p后标记法是应用最广泛，灵敏度最高的8-OHdG检测方法但³²p在实验过程中会对实验人员本身形成放射性损害，且如果实验废液处理不当，还会造成环境污染。所以，该法不适宜推广。另外，常见的8-OHdG检测方法还有高效液相色谱-电化学检测法、高效毛细管电泳法、气相-质谱联用法、同位素稀释质谱法等，但这些方法存在成本高、处理复杂、只能实现微量制备等问题导致无法满足大批量样本快速筛查的需要。酶联免疫吸附试验(ELISA)也是常见的检测手段，ELISA在大多数实验室中易于执行，成本低，灵敏度高，仪器简单。但是准备工作既繁琐又耗时。因此，开发用于检测痕量8-OHdG的高灵敏度，方便且成本有效的传感器是必要的。

适体是使用指数富集的配体系统进化(SELEX)选自随机序列核酸文库的DNA或RNA分子。适体可以高亲和力特异性结合多种靶分子，并且已广泛用作生物传感应用的识别元件，例如荧光，电化学和电化学发光生物传感器。在2009年使用SELEX方法选择了8-OHdG的特异性适体。所选择的适体具有富含G的序列，并且8-OHdG可以诱导其构象以形成G-四链体结构。基于此已经开发了一些用于检测8-OH-dG的适体传感器的方法，例如杂交链反应(HCR)扩增，滚环扩增(RCA)和等温指数扩增。这些方法使信号放大从而提高灵敏性，但是检测的成本高。因此我们在这基础上建立一种灵敏性高，性质稳定且能特异性识别的检测8-OHdG的适体传感器。由于核酸适配体是通过SELEX技术体外筛选出来的能够特异性结合目标配体的寡聚核苷酸片段。以其特有的高亲和力和特异性，可作为识别探针和生物传感器，与蛋白质类抗体相比，核酸适体不仅能高效、特异性地识别和结合各种生物目标分子，还具有易标记、易合成、性质稳定等优势。然而，要获得可行的检测方法，建立高效的适配体传感器是关键所在，首先适体传感器在分子水平上应当满足实验所选择的发光体系的要求，采用何种标记物，标记物在传感器上的连接方法等都需要进行针对性设计；此外，选择何种分离载体和捕获探针可以完整收集信号物质并实现与信号物质含量成有规律的发光反应，也需要根据发光体系、标记物、适配体等物质的性质进行设计；除此之外，发光体系的选择关乎最终检测结果与被检测物质真实含量之间的关系，因此也是影响检测效果的重要因素。