[发明专利]一种用于评估土壤微生物多样性的方法

权利要求书

1.一种用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用嵌套取样的方法进行土壤样本的收集，所述嵌套取样的方法为将第一样本区域嵌套于第二样本区域内进行取样；

所述第一样本区域为：设置参考点，依次按照距离参考点的距离递增的方式设置多个相邻的嵌套正方形，且前一个正方形的四个顶点分别位于后一个正方形的四条边的中点上；所述第二样本区域为：依次按照距离参考点的距离递增的方式设置多个相邻的嵌套正方形，且多个正方形的对角线在一条直线上；

分别从不同的土壤样本中提取微生物总DNA，并应用PCR扩增微生物DNA中的16S rRNA基因；

将不同土壤样本的PCR扩增产物纯化后进行质量鉴定，然后进行混合；

对混合样本的浓度进行定量检测，并进行高通量测序；

获得微生物物种序列后，计算每个样本区域内所包含样本的丰富度值，得到每个样本区域内的物种数量；

根据每个样本区域的位置坐标信息计算每个样本区域的采样面积；将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积进行模型拟合，根据模型拟合结果，得到当地的土壤微生物的物种数量；

所述第一样本区域的每个正方形作为样本区域，每个样本区域的采样面积为每个正方形的面积，参考点和各个正方形的顶点作为采样点，每个采样点取一个土壤样本；

所述第二样本区域的每个正方形作为样本区域，每个样本区域的采样面积为每个正方形的面积，各个正方形的顶点作为采样区域。

2.根据权利要求1所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，设置四个相邻的嵌套正方形，第一个正方形的任意一条边到参考点的垂直距离为0.5m，第二个正方形的任意一个顶点到参考点的距离为1m，第三个正方形的任意一条边到参考点的垂直距离为1m，第四个正方形的任意一个顶点到参考点的距离为2m。

3.根据权利要求1所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，设置三个相邻的嵌套正方形，第五个正方形、第六个正方形和第七个正方形的任意一个顶点到参考点的距离分别为10m、100m和1000m；每个采样区域均为面积1m²的正方形，每个采样区域设置五个采样点，分别为正方形的四个顶点和一个正方形的中心点，每个采样点取一个土壤样本。

4.根据权利要求1所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，应用PCR扩增微生物DNA中的16S rRNA基因的V3-V4区域，上下游引物分别为：515F：5＇-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3＇；806R：5＇-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3＇。

5.根据权利要求1所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，所述将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积进行模型拟合的步骤包括：将每个样本区域内的物种数量与每个样本区域的采样面积采用不同的拟合方程进行拟合，根据相关系数r2和AIC指数筛选最适合的模型；其中拟合方程包括：S＝cAz，S＝c+zlog(A)，S＝c(1-exp(-zA))，S＝(cA)/(z+A)，S＝c/(1+exp(-zA+f))，S＝(c+zA)/(1+fA)，S＝c/(1+zlog(f/A))和S＝c(1-exp(-zAf))；其中，S为物种数，A为采样面积，z为曲线的斜率，c、f为拟合参数。

6.根据权利要求5所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，所述根据模型拟合结果，得到当地的土壤微生物的物种数量的步骤包括：将各个样本区域的采样面积总和代入到筛选得到的模型中，得到当地的土壤微生物的物种数量。

7.根据权利要求1所述的用于评估土壤微生物多样性的方法，其特征在于，所述质量鉴定包括DNA浓度和纯度的鉴定，DNA浓度在10-60ng/μL，A260/280在1.8-2.0之间；所述混合为将不同土壤样本的PCR扩增产物按等质量进行混合；所述混合样本的浓度大于20ng/ul。