[发明专利]基因表达盒及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种基因表达盒及其应用。该基因表达盒包含：a.缺乏启动子的第一报告基因；以及b.位于a的5’端的片段，其序列中至少包含两个不同的酶切位点。5’端的片段能够形成一个高通量捕获组成型启动子的“鸟笼”结构，若“鸟笼”中插入的片段可使得所述第一报告基因表达，则说明该插入的片段中包含适合于宿主细胞的启动子，由此可进行高通量的启动子筛选。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种基因表达盒及其应用。

背景技术

启动子是基因有效表达和基因工程产业化的一个关键元件，它决定一个基因产物的产量高低和生产工艺技术的水平。

利用基因工程技术生产重组蛋白，目前普遍采用以宿主细胞，特别是大肠杆菌(E.coli)为外源基因宿主菌的诱导型表达系统。以下以最常见的宿主细胞——大肠杆菌为例来说明诱导型表达系统的缺陷。该表达系统广泛使用的是以乳糖操纵子(lac operon)的启动子为基础改造而来的各种启动子(包括trc,lac,tac,lacUV5-T7等)。利用大肠杆菌表达系统生产重组蛋白的优点是：大肠杆菌容易培养、发酵周期短、单位时间产量比酵母和哺乳动物细胞高，培养基的成本低。因此目前大多数实现重组蛋白规模化生产的仍然是使用诱导型大肠杆菌表达系统。

但是诱导型表达系统的缺点也非常明显：1，该表达系统需要添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作为诱导物。由于IPTG价格昂贵并且有毒，不利于药用重组蛋白的生产，药用重组蛋白明文规定不得使用IPTG；2，大肠杆菌表达外源基因通过诱导剂(IPTG)或物理方法(温敏)进行诱导，诱导时机和诱导强度对于外源基因的表达至关重要，不容易掌握；3，诱导后菌体生长停止，无法进行高密度培养，生物量和外源蛋白的表达量一般不会很高；4，大肠杆菌没有完整的分泌机制，大多数外源基因在诱导高表达时往往形成不溶性的包涵体留在细胞内。这给后续的提取工艺带来了极大的麻烦，变性、复性过程繁琐耗时，并常常会出现错配，重组蛋白的回收率一般不超过30％。

这是诱导型表达系统一直面临的最大技术障碍。建立大肠杆菌组成型分泌表达系统是克服这个技术障碍最有效的方法。田林奇等人(《中国生物工程杂志》，2010,30(3):61～66)把大肠杆菌S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因和包括该基因5’-端组成型启动子序列的整个DNA片段克隆在大肠杆菌pBR322质粒上并转化大肠杆菌，实现了S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)基因的组成型表达。宫长斌(《过程工程学报》，第7卷第3期，2007年6月)将pUC19载体上乳糖操纵子的转录起始部位+5～+17间的几处碱基进行了突变，变为组成型启动子，实现了天冬氨酸转氨酶AspAT的组成型表达。

上述两例均为利用大肠杆菌基因自身的、或人工突变的组成型启动子实现大肠杆菌自身基因的组成型表达。

H.Poo等人(Biotechnol.Lett.24(2002)1185–1189)克隆了地芽孢杆菌(Geobacillus toebii)的D-氨基酸氨基转移酶基因，并鉴定了位于该基因上游5’-端的启动子序列。H.Poo等人利用该异源启动子在大肠杆菌(E.coli)实现了重组人肿瘤坏死因子(rhTNF)的组成型表达。Ki Jun Jeong等(Protein Expression and Purification 36(2004)150–156)利用该异源组成型启动子在大肠杆菌(E.coli)中表达了人瘦素(leptin)基因，不添加任何诱导剂，在流加补料的情况下获得了2.1g/L的瘦素。文献中未见目标蛋白可溶性分泌表达的任何提示，推测应为胞内表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可用于通过高通量筛选组成型启动子的方法及系统，以简化药用重组蛋白工业化生产工艺过程。

本发明涉及一种基因表达盒，包含：

a.SEQ ID NO:1所示的片段，其为缺乏启动子的四环素抗性基因，且所述四环素抗性基因5’端的片段包含BglII、NdeI以及EcoRI酶切位点；