[发明专利]壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法和应用

说明书

本发明提供一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法和应用，涉及细胞工程技术领域。本发明的制备方法包括以下步骤：预处理：清洗壁蜕膜组，离心，去除上清液；消化：将壁蜕膜组织剪碎，加入组织消化液进行消化，消化完成分离上清液和沉淀，将沉淀重悬得悬液；所述组织消化液中包括Tryple酶、生理盐水、I型胶原酶和Ⅱ型胶原酶，所述Tryple酶的体积浓度为40～60％，I型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL，Ⅱ型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL；分离：向悬液中加入淋巴细胞分离液，离心，分层后分离出单个核细胞，离心，保留沉淀，加入培养液，混匀，即得壁蜕膜亚全能干细胞分离液。本发明可以成功从壁蜕膜组织中提取亚全能干细胞，细胞活性好、分化能力强。

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，特别是涉及壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法和应用。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制、更新和多向分化潜能的细胞，可以分化为各种组织器官，干细胞已经成为生命科学领域的研究热点。科学家发现多种成体组织中都存在一类原始干细胞群体，它们和造血干细胞、神经干细胞等多能干细胞不同，多能干细胞只能分化为特定胚层的细胞，而这类原始干细胞可分化为不同胚层的组织细胞。这类原始干细胞还区别于胚胎干细胞，在个体生长发育过程中逐渐失去部分分化潜能，并且会出现一些特殊表型或者分子标志，被称为成体亚全能干细胞。亚全能干细胞具有下列特性：可分化为不同胚层的细胞，胚胎期的亚全能干细胞可分化为不同类型的多能干细胞，并在生长发育和新陈代谢中维持平衡；参与机体自我修复和更新，不仅能分化为所在器官的组织特异性细胞，参与器官重塑，还可以在炎症因子或者生长因子的趋化作用下，远处转移修复受损组织。因此，成体亚全能干细胞在参与组织损伤修复和弥补干细胞数量不足上都发挥着重要的作用，能够分离纯化、培养和可有效利用的成体亚全能干细胞具有重要意义。

目前，亚全能干细胞的提取存在一些阻碍，一方面现有的亚全能干细胞大多数是从人胎盘中提取得到，存在一定的伦理问题，另一方面现有的提取方法得到的亚全能干细胞活性低、分化能力有限，限制了亚全能干细胞在临床治疗中的应用。

发明内容

基于此，有必要针对上述问题，提供一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，该方法提取的壁蜕膜亚全能干细胞的数量多、活性好、分化能力强，为临床治疗提供基础。

一种壁蜕膜亚全能干细胞的制备方法，包括以下步骤：

预处理：清洗壁蜕膜组织，离心，去除上清液；

消化：将壁蜕膜组织剪碎，加入组织消化液进行消化，消化完成分离上清液和沉淀，将沉淀重悬得悬液；所述组织消化液中包括Tryple酶、生理盐水、I型胶原酶和Ⅱ型胶原酶，所述Tryple酶的体积浓度为40～60％，I型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL，Ⅱ型胶原酶的质量浓度为0.8～1.2mg/mL；

分离：向悬液中加入淋巴细胞分离液，离心，分层后分离出单个核细胞，离心，保留沉淀，加入培养液，混匀，即得壁蜕膜亚全能干细胞分离液。

上述制备方法，使用组织消化液成功从壁蜕膜组织中提取到亚全能干细胞，提取得到的细胞数量多、纯度高、活性好、分化能力强，可应用于临床；本发明的方法提供了一种新的亚全能干细胞提取来源——壁蜕膜组织，壁蜕膜组织来源丰富，不存在伦理争议，具有广阔的应用前景。

在其中一个实施例中，所述预处理步骤中，离心转速为1000～1500r/min，离心时间为4～6min；所述清洗液包括：生理盐水、体积分数为45～55％的红细胞裂解液、8～12μg/ml的硫酸庆大霉素、8～12μg/ml的两性霉素B。细胞裂解液可以裂解将红细胞，清除血液，减少污染。

在其中一个实施例中，所述消化步骤具体为：将壁蜕膜组织剪碎成0.1～1cm³的碎块，加入0.8～1.5倍体积的组织消化液，混合均匀，在恒温震荡仪中震荡消化1～4h，温度控制为37±0.5℃，震荡转速为180～220r/min，消化完成分离上清液和沉淀，向沉淀中加入生理盐水重悬。