[发明专利]一种用于肿瘤早期筛查和诊断的标志物、试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种用于肿瘤早期筛查和诊断的标志物，其特征在于：所述标志物为色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，所述色氨酸5-单加氧酶激活蛋白是YWHAZ基因mRNA的表达产物。

2.根据权利要求1所述的一种用于肿瘤早期筛查和诊断的标志物，其特征在于：所述YWHAZ基因的引物有上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID NO .3，下游引物序列为SEQ ID NO .4。

3.一种用于肿瘤早期筛查和诊断的试剂盒，其特征在于：包含如权利要求1或2中任一项所述的用于肿瘤早期筛查和诊断的标志物，以及含有特异性检测的引物，所述引物用于检测样本中YWHAZ基因mRNA的表达水平。

4. 根据权利要求3所述的一种用于肿瘤早期筛查和诊断的试剂盒，其特征在于：所述引物以β-actin基因为内参，检测YWHAZ基因mRNA表达水平，即YWHAZ基因mRNA表达的ΔCT值，所述β-actin基因具有上游引物和下游引物，其上游引物序列为SEQ ID NO .1，下游引物序列为SEQ ID NO .2。

5.根据权利要求3所述的一种用于肿瘤早期筛查和诊断的试剂盒，其特征在于：所述检测样本为胸腔积液，所述肿瘤是指肺癌，包括良性肿瘤和恶性肿瘤。

6.一种使用如权利要求1或2中任一项所述的用于肿瘤早期筛查和诊断的标志物的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)按照排除标准进行选定患者并签署知情同意书，恶性胸腔积液选定标准：胸腔积液中找到癌细胞或通过病理组织找到癌细胞，良性胸腔积液选定标准：结核或心力衰竭或低蛋白血症等所致胸腔积液；

(2)在无菌要求，采集病人胸腔积液10ml/人，于15ml去酶离心管中。将盛有标本的15ml去酶离心管放入，低温超速离心机中离心，离心条件为4℃，1000rpm，离心10min；

(3)离心后取沉淀至1.5ml离心管中，Trizol液按每0.1ml胸水沉淀加入1ml的比例加入，吹打、混匀，室温放置5min；

(4)氯仿按每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入，并剧烈震荡15s，静置2min；

(5)取上层水相于一新的离心管，异丙醇按每1mlTrizol液加入0.5ml的比例加入，室温放置10min，再4℃，12000rpm离心10min；

(6)弃去上清液，75%乙醇按每1mlTrizol液加入1ml的比例加入，涡旋混匀，再4℃，7500rpm，离心5min；

(7)小心弃去上清，然后室温或真空干燥5-10min，再加入DEPC水将沉淀溶解；

(8)纯浓度检测：取2ulRNA样本，在NANODROP LITE核酸蛋白检测仪上测定吸光度值，即OD值，OD260/280比值全部在1.8-2.0范围内；

(9)逆转录实验：按逆转录实验分别进行加样，加样后按照：37℃，15min→85℃，5s→4℃，∞进行逆转录实验，得到后续PCR扩增实验所需cDNA；

(10)PCR扩增实验：按PCR扩增实验分别进行加样，加样后按照：94℃，1min→94℃，30s→56℃，30s→72℃，并按此工艺条件下循环40次，然后按照：72℃，10min→4℃，∞进行PCR扩增实验；

(11)对胸腔积液中YWHAZ基因进行接受者操作特性曲线和诊断指数及可信区间分析，确定胸腔积液中YWHAZ基因mRNA的相对表达量，通过相对表达量来筛查和诊断肿瘤的类别。

7. 根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于：在所述步骤(11)通过相对表达量来筛查和诊断肿瘤过程中，具体判定标准为，胸腔积液中YWHAZ基因的mRNA表达的ΔCT值，当ΔCT值在4±0.47范围，可认为是恶性胸腔积液，恶性胸腔积液中YWHAZ 基因的mRNA的相对表达量表达高于良性胸腔积液，为1.641±0.635倍，且P0.05具有统计学意义；而肺癌Ⅲ/Ⅳ期恶性胸腔积液中YWHAZ基因的 mRNA的表达高于肺癌Ⅰ/Ⅱ期恶性胸腔积液中YWHAZ基因的 mRNA的表达，为14.450±0.859倍，且P0.05具有统计学意义。