[发明专利]重组谷氨酸棒杆菌及生产L-苏氨酸的方法

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及重组谷氨酸棒杆菌及生产L‑苏氨酸的方法。本发明组合改造(或增强)抗反馈抑制的hom基因、lysC基因、thrC基因等，及(或)弱化(或敲除)pck基因和(或)弱化(或敲除)pyk基因，构建了生产苏氨酸的谷氨酸棒杆菌，产酸效果非常显著，远超出了目前有报道的最高水平达到20g/l。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及重组谷氨酸棒杆菌及生产L-苏氨酸的方法。

背景技术

L-苏氨酸(L-Threonine)，化学名称为β-羟基-α-氨基丁酸，分子式为C₄H₉NO₃，相对分子质量为119.12。苏氨酸为白色斜方晶系或结晶性粉末。无臭，味微甜。253℃熔化并分解。高温下溶于水，25℃溶解度为20.5g/100ml。等电点5.6。不溶于乙醇、乙醚和氯仿。

L-苏氨酸是一种必需的氨基酸，苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。特别是饲料添加剂方面的用量增长快速，它常添加到未成年仔猪和家禽的饲料中，是猪饲料的第二限制氨基酸和家禽饲料的第三限制氨基酸。在配合饲料中加入L-苏氨酸，具有如下的特点：①可以调整饲料的氨基酸平衡，促进禽畜生长；②可改善肉质；③可改善氨基酸消化率低的饲料的营养价值；④可降低饲料原料成本；因此在欧盟国家(主要是德国、比利时、丹麦等)和美洲国家，已广泛地应用于饲料行业。

苏氨酸的生产方法主要有发酵法，蛋白质水解法和化学合成法三种，目前微生物发酵法已经成为生产苏氨酸的主流方法，目前生产苏氨酸的微生物主要为大肠杆菌及棒杆菌，其中大肠杆菌生产苏氨酸的研究已经比较透彻，但大肠杆菌内毒素的存在影响着其应用范围，而关于利用棒杆菌生产苏氨酸的研究相对较少。

棒杆菌是用于生产L-氨基酸的代表性微生物，特别是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、北京棒杆菌(Corynebacterium pekinense)和黄色短杆菌(Breviabacterium flavum)。为了改善这些微生物的L-苏氨酸生产能力，可以通过传统诱变和代谢工程等方法对生产菌株进行不断地改造。

谷氨酸棒杆菌中，由草酰乙酸生成苏氨酸需要五步催化反应，分别为天冬氨酸激酶(lysC编码)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd编码)、高丝氨酸脱氢酶(hom编码)、高丝氨酸激酶(thrB编码)以及苏氨酸合酶(thrC编码)。Hermann Sahm等人一直致力于高产苏氨酸的谷棒菌株的开发，并取得一定突破，获得了抗反馈抑制的hom基因、lysC基因。继Hermann Sahm之后，Lothar Eggling在该领域进行了进一步的探索，弱化苏氨酸利用途径中的编码基因glyA，同时过表达苏氨酸外运蛋白ThrE，使得苏氨酸的产量由49mM提高到67mM；其研究团队考察了大肠杆菌中苏氨酸外运蛋白在谷氨酸棒杆菌中的表现，发现将rhtC引入到谷氨酸棒杆菌中，有利于苏氨酸的外运。

目前关于利用谷氨酸棒杆菌生产苏氨酸的研究主要集中在苏氨酸合成的末端途径及苏氨酸的外运这两个方面，而关于苏氨酸前体物草酰乙酸的合成的报道较少。采用代谢工程的思路，利用基因改造技术改造谷氨酸棒杆菌生产苏氨酸的报道中苏氨酸的产量最高为11.8g/l。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供重组谷氨酸棒杆菌及生产L-苏氨酸的方法。通过调整代谢途径中pck、pyk、lysC、hom、thrB、thrC基因的表达，实现了苏氨酸的高表达。

本发明提供的重组谷氨酸棒杆菌，其lysC、hom、thrB、thrC基因中至少一个的表达被强化。

在一些实施例中，所述重组谷氨酸棒杆菌中，lysC、hom、thrB、thrC基因中至少一个的表达被强化；且pck和/或pyk基因的表达被弱化。

本发明中，所述lysC基因的强化包括I)～III)中至少一种：