[发明专利]一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒

说明书

本发明公开了一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒，包括长度多态性遗传标记和质控位点的引物组合物、Taq DNA聚合酶、PCR扩增的缓冲液、对照基因组DNA、纯水，其中，多态性遗传标记和质控位点的引物组合物包括单条引物含有荧光素标记的如SEQ·ID·No.1～SEQ·ID·No.20所示的引物对。本发明所提供的通用试剂盒可对目标区域CNV拷贝数为0、1、2、3或以上进行准确判断，既适用于拷贝数增加也适用于拷贝数减少，有效克服了一代测序方案和实时荧光方案的缺点，且无需制备标准曲线，操作简单，准确度高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于片段分析技术验证拷贝数变异的通用试剂盒。

背景技术

拷贝数变异(CopyNumber Variations，CNVs)通常指长度涉及1kb或以上的DNA片段的缺失(拷贝数减少)、重复(拷贝增加)等，这种类型的变异是目前在人类遗传学领域、肿瘤学领域中的研究热点之一。如Zarrei M等在2015年报告了人类全基因组CNV图谱(ZarreiM,et al.Nat Rev Genet.2015；16(3):172-83.)，Liang等发现通过测序方法对CNV进行检测有助于人类染色体病综合征的诊断(Liang D,et al.J Mol Diagn.2014；16(5):519-526.)；而Shao等则在2019年发现CNV与泛肿瘤组织中的基因表达情况密切相关(Shao X,etal.BMC Med Genet.2019；20(1):175.)。

CNV检测方案依据位点通量的不同，可分为高通量检测技术和低通量检测技术。高通量检测技术通常包括比较基因组杂交(aCGH)技术(Zhang,et al.Methods MolBiol.2017；1541:167-179.)、基于单核苷酸多态性的基因芯片(Uddin M,et al.GenetMed.2015；17(9):747-52.)，以及基于二代测序技术的CNV-seq(CN201680067423.2；Xie C,et al.BMC Bioinformatics.2009；10:80；Liang D,et al.JMol Diagn.2014；16(5):519-526.)等。上述这些高通量的CNV分子检测手段通常用于科学研究或疾病的筛查。对于这些高通量分子手段所发现的、有进一步研究价值或可能与疾病相关的CNV，通常需要针对这些特定的CNV的拷贝数进行验证。特定CNV拷贝数的验证通常采用的是一些成本更低的、通量较低的、检测结果更为可靠的技术手段，这通常包括FISH、实时荧光PCR、MLPA、甚至一代测序的方法。

FISH即原位荧光杂交，这是一种相对传统与成熟的检测方案，是依据所发现的特定CNV区域的序列特征设计特异性的探针，探针采用荧光标记，在培养细胞中进行原位杂交后通过荧光显微镜直接观察。如Abbott公司已开发了一系列针对人类染色体病或基因组病的FISH探针(https://www.molecular.abbott/int/zh/vysis-fish-chromosome-search)。

多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probeamplification,MLPA，Schouten等，2002)是MRC-Holland公司(http://www.mrc-holland.com/)的专利技术，该公司也依据这一技术，开发了一系列与特定CNV拷贝数检测相关的产品，如SALSAMLPAP060SMACarrier probemix，可对人类5号染色体长臂区域的SMN1与SMN2的拷贝数进行相对定量检测。

实时荧光技术是一种相对简单与低成本的特定CNV拷贝数验证的技术方案。采用这一技术方案时，需要在所发现的CNV区域设计特异性的PCR引物与Taq-Man探针，同时设计内参基因的PCR引物与探针，通过制备标准曲线的方法获得目标区域的相对拷贝数定量结果，如申请号为201810096023.5的专利技术方案。