[发明专利]一种表达CBDAS的重组酿酒酵母及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种表达CBDAS的重组酿酒酵母及其构建方法和应用，将CBDAS定位于酿酒酵母的内源内质网定位肽的网膜上表达，获得表达CBDAS的重组酿酒酵母，首先以酿酒酵母的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂416d‑Up片段和下游同源臂416d‑Down片段；然后以质粒pZF048或pZF049为模板，通过PCR扩增得到Gal1‑CBDAS‑CEN1‑tADH1片段或；Gal1‑CBDAS‑CYB5‑tADH1片段，将这些片段转化至酿酒酵母中，获得表达CBDAS的重组酿酒酵母，通过使用酿酒酵母自身内质网定位肽表达异源蛋白CBDAS，提高了该酶的表达活性，增加了产物CBDA的产量。

技术领域

本发明涉及合成生物学技术领域基因工程改造技术，更具体地，本发明涉及在酿酒酵母中利用内源内质网定位肽构建的CBDAS高活性表达菌株及其构建方法和应用。

背景技术

大麻素是大麻植物的次级代谢产物，随着大麻素的工业开发和利用，2020年的产值预计达到1000亿美元。目前，已发现的大麻素种类超过100种，主要包括大麻二酚(cannabidiol CBD)、四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol,THC、大麻酚(cannabinol,CBG)和大麻环萜酚(cannabichromene,CBC)等，其中互为同分异构体CBD和THC含量最高。与致幻作用的THC相比，非精神活性的CBD具有更加良好的应用前景。CBD通过与人体大脑中的CB1受体和免疫细胞中的CB2受体结合，行使抗肿瘤、神经保护、代谢和免疫调节、抗炎抗氧化、保护心血管和护肝等功效。2018年6月25日，FDA采用优先审批程序首次批准了工业大麻植物来源的CBD处方药Epidiolex，用于治疗两种非常严重且罕见的婴儿癫痫病Dravet综合征和Lennox-Gastut综合症。

工业生产上，首先是提取大麻植物合成的前体大麻二酚酸CBDA，再经过脱羧后获得CBD。然而，从大麻植物中获取CBDA的方法，存在培养时间长、效率低、成本高、造成生物质浪费、产品纯度低和含致幻THC的风险等缺点。因此，采用合成生物学技术，以酿酒酵母为细胞工厂高效生产CBDA十分必要。CBDA从头生物合成途径如图1所示，大麻萜酚酸(cannabigerolic acid,CBGA)是合成CBDA的重要前体化合物，通过大麻二酚酸合酶CBDAS转化为CBDA。为了增加CBDA的生物合成产量，表达具有高活性的CBDAS是关键的步骤之一。本专利首次通过使用酿酒酵母内源内质网定位肽，将CBDAS定位于内质网膜上表达，能极大地提高CBDAS的生物活性，增加产物CBDA的产量。

发明内容

本发明克服了现有技术的不足，提供一种表达CBDAS的重组酿酒酵母及其构建方法和应用。

为解决上述的技术问题，本发明的一种实施方式采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种表达CBDAS的重组酿酒酵母的构建方法，将CBDAS定位于酿酒酵母的内源内质网定位肽的网膜上表达，获得表达CBDAS的重组酿酒酵母。

所述的表达CBDAS的重组酿酒酵母的构建方法中，使用的内质网定位肽包括CEN1和CYB5。

所述的表达CBDAS的重组酿酒酵母的构建方法中，将CBDAS定位于酿酒酵母的内源内质网定位肽的网膜上表达的其中一种方式包括以下步骤：

(1)以酿酒酵母的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂416d-Up片段；

(2)以酿酒酵母的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂416d-Down片段；

(3)以质粒pZF048为模板，通过PCR扩增得到Gal1-CBDAS-CEN1-tADH1片段；

(4)将416d-Up、Gal1-CBDAS-CEN1-tADH1、416d-Down作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得表达CBDAS的重组酿酒酵母。