[发明专利]一种表达CBDAS的重组酿酒酵母及其构建方法和应用在审
| 申请号： | 202010120594.5 | 申请日： | 2020-02-26 |
| 公开（公告）号： | CN113999870A | 公开（公告）日： | 2022-02-01 |
| 发明（设计）人： | 张云丰;李宗瑾;许薷芳;罗小舟 | 申请（专利权）人： | 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/81 | 分类号： | C12N15/81;C12N1/19;C12P7/42;C12N9/10;C12R1/865 |
| 代理公司： | 深圳市港湾知识产权代理有限公司 44258 | 代理人： | 刘向英 |
| 地址： | 518000 广东省深圳市南山区粤海*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 表达 cbdas 重组 酿酒 酵母 及其 构建 方法 应用 | ||
1.一种表达CBDAS的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于将CBDAS定位于酿酒酵母的内源内质网定位肽的网膜上表达，获得表达CBDAS的重组酿酒酵母。
2.根据权利要求1所述的表达CBDAS的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于使用的内质网定位肽包括CEN1和CYB5。
3.根据权利要求2所述的表达CBDAS的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于所述将CBDAS定位于酿酒酵母的内源内质网定位肽的网膜上表达包括以下步骤：
(1)以酿酒酵母的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂416d-Up片段；
(2)以酿酒酵母的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂416d-Down片段；
(3)以质粒pZF048为模板，通过PCR扩增得到Gal1-CBDAS-CEN1-tADH1片段；
(4)将416d-Up、Gal1-CBDAS-CEN1-tADH1、416d-Down作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得表达CBDAS的重组酿酒酵母。
4.根据权利要求2所述的表达CBDAS的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于所述将CBDAS定位于酿酒酵母的内源内质网定位肽的网膜上表达包括以下步骤：
(1)以酿酒酵母的基因组为模板，通过PCR扩增得到上游同源臂416d-Up片段；
(2)以酿酒酵母的基因组为模板，通过PCR扩增得到下游同源臂416d-Down片段；
(3)以质粒pZF049为模板，通过PCR扩增得到Gal1-CBDAS-CYB5-tADH1片段；
(4)将416d-Up、Gal1-CBDAS-CYB5-tADH1、416d-Down作为插入片段转化至酿酒酵母中，获得表达CBDAS的重组酿酒酵母。
5.根据权利要求3或4所述的表达CBDAS的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于所述转化至酿酒酵母的方法为醋酸锂/PEG3350法；所述酿酒酵母是菌株ySC-31。
6.根据权利要求5所述的表达CBDAS的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于所述醋酸锂/PEG3350法的步骤包括：将酿酒酵母接种到YPD培养基中稀释至OD值为0.2，培养至少4.5h，收集细胞，将含有所述插入片段与质粒pCUT-416d的转化液与细胞混合，42℃培养孵育，然后收集细胞。
7.根据权利要求6所述的表达CBDAS的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于所述插入片段的用量为：每5OD酿酒酵母菌液中的细胞，对应使用50μL DNA混合物悬浮该细胞，50μLDNA混合物由2μg所述插入片段、250ng质粒pCUT-416d以及足量ddH2O混合而成。
8.根据权利要求5所述的表达CBDAS的重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于所述插入片段转化至酿酒酵母后，将收集到的细胞涂布到缺少尿嘧啶的筛选平板上，获取单克隆菌落，测序验证后进行保存。
9.采用权利要求1-8任意一项所述的构建方法得到的表达CBDAS的重组酿酒酵母。
10.权利要求9所述的重组酿酒酵母发酵生产CBDAS或CBDA的应用。
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