[发明专利]生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌及其构建方法与应用，构建方法为：分别构建基础载体pSI‑SPE、pSII‑CM和pSIII‑KAN：再进一步构建pSI‑ispA‑gpps‑idi1sc、pSII‑idi1_sc和pSIII‑tps21，转入聚球藻UTEX 2973中，生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌。本发明的方法围绕石竹烯高效生物合成的限速问题对聚球藻UTEX 2973进行系统的针对性改造，实验证明，本发明的基因工程菌最终石竹烯的产量在96h达到212.37μg/L，单位时间产量为现有技术的8倍，这对利用光合微生物生产石竹烯具有重要的理论及实际意义。

技术领域

本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种生物合成石竹烯的聚球藻基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

β-石竹烯(β-caryophyllene，简称为石竹烯)是一种双环倍半萜类化合物，分子式为C₁₅H₂₄，常温下不溶于水，仅溶于乙醇、氯仿等有机熔剂，石竹烯广泛存在于各种植物之中，在植物抵抗细菌、真菌感染以及虫害中有重要作用。石竹烯常温下为无色至微黄色液体，有丁香气味，味道温和，因此在中国被批准为允许使用的食品香料(GB 2760-1996)，此外在药品、化妆品等方面都有广泛应用。同时又由于其有较高的密度和燃烧热，因此被列为下一代航空燃料。目前石竹烯的来源主要依赖自植物中提取，同时早在1964年就实现了石竹烯的化学合成，但这些方法都面临着效率低，浓度低，类似物难以分离，回收率低等问题。近年来随着“微生物细胞工厂”的兴起，以微生物作为宿主生产化合物受到了更多的关注，为石竹烯的合成提供了新的思路。

与其他萜烯类化合物的合成类似，在合成石竹烯的宿主中，经由甲羟戊酸(MVA)途径或2-C-基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(MEP)途径合成萜烯的前体物质二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)以及异戊二烯焦磷酸(IPP)，随后二者在牻牛儿基焦磷酸合成酶(GPPS)的作用下合成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，随后在法尼基焦磷酸合酶(FPPS)的作用下与一分子异戊二烯焦磷酸加成生成法尼基焦磷酸(FPP)。最后在石竹烯合酶(CS)的作用下合成石竹烯。早在2011年，有研究者在工程菌内实现了石竹烯的异源生物合成。通过过表达Artemisia annua来源的石竹烯合酶(QHS1)在光和蓝细菌集胞藻PCC 6803中实现了46.4±2.9μg/L/week的石竹烯产量，此后在大肠杆菌中研究者通过引入MVA途径，加强从五碳前体DMAPP和IPP到倍半萜前体FPP的转化以及投入可快速转化MVA途径前体乙酰辅酶A的乙酸盐实现了72小时1.05g/L的石竹烯产量。

尽管在大肠杆菌中，石竹烯的生产取得了较好的成果，但是大肠杆菌等异养生物发酵，消耗大量的糖类等生物质，可能存在与人争粮等问题，并造成一些经济和道德影响。由于蓝细菌能够仅利用空气中的二氧化碳以及光照作为唯一碳源和能量来源，因此，光和蓝细菌作为传统上以生物质作为基础的“微生物细胞工厂”的替代品来生产绿色燃料及化学品受到了广泛的关注，目前已经实现了以二氧化碳为底物合成几十种化合物。