[发明专利]一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与应用

说明书

本发明公开了一种弓形虫双基因缺失虫株的构建方法及其在作为弱毒疫苗中的应用。该弓形虫双基因缺失虫株是在弓形虫RHΔKu80虫株的基础上，利用CRISPR/Cas9基因敲除技术，同时敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因(ddi1)和紫外剪切修复蛋白23基因(rad23)两个基因，获得ΔΔddi1rad23双基因缺失虫株。通过实验证明：ΔΔddi1rad23双基因缺失虫株的生长繁殖能力和毒力明显降低，使用该虫株免疫小鼠后再次攻击强毒株能够对小鼠提供较好的保护，可有效抵抗弓形虫再次感染。本发明的弓形虫双基因缺失虫株有作为弓形虫弱毒活疫苗的潜力，为进一步研制弓形虫弱毒疫苗奠定基础。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与应用，特别涉及泛素-蛋白酶体系统中的两个穿梭蛋白基因缺失的弓形虫虫株及其构建方法与在作为弓形虫弱毒疫苗中的应用。

背景技术

龚地弓形虫(Toxoplasma gondii，简称弓形虫)是一种专性细胞内寄生原虫，隶属于顶复亚门，几乎感染所有的温血动物和人，是一种危害严重的人兽共患病原。弓形虫感染广泛，危害宿主的形式多样，对不同宿主、不同生长或生理阶段的危害程度也有很大差异。在宿主免疫力正常的情况下，大多为隐性感染；婴儿、免疫抑制患者感染弓形虫可能导致严重或致命的疾病，弓形虫感染还是导致妊娠动物和孕妇发生流产、死胎及其他繁殖生殖障碍的重要原因，在我国常有仔猪急性弓形虫病的报道。

目前，弓形虫病的防治手段主要是磺胺类药物用于急性弓形虫病的治疗，但并不能彻底治愈弓形虫病。上个世纪九十年代，在欧洲有一种弱毒疫苗应用于预防绵羊弓形虫病引起的流产，但因为效果及其公共卫生问题，未能够广泛应用；迄今未见其它商品化疫苗应用于人和动物的弓形虫病预防。因此，研发弓形虫病疫苗具有重要应用价值。

DNA损伤诱导蛋白1(ddi1)和紫外剪切修复蛋白23(rad23)都属于UBL-UBA穿梭蛋白家族，该家族蛋白是泛素-蛋白系统的重要组成成分，主要功能是识别和转运泛素化蛋白到蛋白酶体进行降解，这对于维持细胞内蛋白质及氨基酸的稳态具有重要作用，除此之外，还参与DNA损伤修复、细胞周期调控等生命过程，但迄今尚无其在弓形虫中的研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种弓形虫双基因缺失虫株及其构建方法与在作为弓形虫弱毒疫苗中的应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了一种弓形虫双基因缺失虫株的构建方法。

本发明提供的弓形虫双基因缺失虫株的构建方法包括如下步骤：抑制或沉默弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的表达，得到所述弓形虫双基因缺失虫株；

所述DNA损伤诱导蛋白1基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述紫外剪切修复蛋白23基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

上述方法中，所述抑制或沉默弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因的表达为敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因。

进一步的，所述敲除弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因为将所述弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因均替换为抗性基因。

更进一步的，所述将弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因和紫外剪切修复蛋白23基因均替换为抗性基因的方法为基于CRISPR/Cas9介导的同源重组技术。所述方法包括如下步骤：

1)将含有抗性基因甲的同源重组片段和靶向DNA损伤诱导蛋白1基因的CAS9质粒导入弓形虫虫株中，使所述弓形虫虫株中的DNA损伤诱导蛋白1基因替换为抗性基因甲，经过筛选和鉴定，得到缺失DNA损伤诱导蛋白1基因的弓形虫虫株；