[发明专利]一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。为提高间苯三酚生物合成效率，本发明提供了一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌,以大肠杆菌为出发菌株，过表达突变了两个关键位点的乙醇脱氢酶基因adhE(A267T,E568K)(267位的丙氨酸突变为苏氨酸，568位的谷氨酸突变为赖氨酸)，聚酮合酶基因phlD。本发明首次实现以乙醇为碳源，经乙酰辅酶A转化形成间苯三酚的生物合成路径，为乙醇的生物利用以及间苯三酚的微生物合成提供了新的技术方法。

技术领域

本发明涉及一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

间苯三酚及其衍生物是生物系统中广泛存在的一类次级代谢产物，广泛存在于多种植物与微生物中。间苯三酚作为重要的精细化学品之一，其及其衍生产品广泛应用于不同领域具有很高的商业价值。间苯三酚广泛应用于医药行业，其既是合成癌症治疗药物黄酮类化合物的中间体，自身又可作为一种药物作用于平滑肌，解除解痉症状其优点在于不会产生一系列抗胆碱样以及其他心血管方面的副作用。同时还常用产妇阵痛，能显著缓解产妇的不适感。间苯三酚可增加了过氧化氢酶活性及其蛋白的表达，具备抗氧化抗炎的效果，能用于水果防腐等方面。此外间苯三酚是化工生产的重要原料，能充作多种物系，如戊二醛溶液、合成橡胶、复合改性双元燃料火箭推进剂(CMDB)的稳定剂；也能用于新型酞类燃料的合成；它也可广泛用于轮胎增粘剂以及偶氮复合油墨等原料简。间苯三酚也常应用于农业生产，酰基化间苯三酚通常具有良好的生物活性，例如2，4-二乙酰基间苯三酚能够防治多种植物病害，能够很好地抑制真菌以及线虫。

上世纪50年代开始，人们在探索间苯三酚合成工艺的进程中发明了几种有明显优势的化学合成方法，包括三硝基甲苯(TNT)法、异丙基苯法、氯代苯法和苯胺法。间苯三酚作为一种药物中间体要求有较高的纯度，在化学合成方法中，因氧化及酸分解过程中产生大量的副产物，使得最终产品的分离提纯比较困难，这些副产物与间苯三酚性质相似，加之间苯三酚的易氧化性和较差的热稳定性，因此用简单的物理方法很难得到高纯度产品。作为一种精细的化工用品，在工业生产和医药生产中的广泛应用与间苯三酚的合成困难形成鲜明对比，尤其是间苯三酚在医药产业中的应用对其纯度有更高的要求。

鉴于化学法生产间苯三酚存在安全隐患、污染大、质量以及纯度低等问题，研究者开始转向用微生物生产间苯三酚。生物合成主要是通过构建基因工程大肠杆菌，异源表达合成间苯三酚的基因，发酵产生间苯三酚。通过基因工程手段不断优化工程菌株，增强大肠杆菌对间苯三酚的抗性作用，同时还要对间苯三酚的发酵工艺进行优化，提高间苯三酚的合成浓度和产率。

发明内容

为提高间苯三酚生物合成效率，本发明提供了一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供一种利用乙醇生产间苯三酚的重组菌，所述重组菌过表达突变的乙醇脱氢酶基因adhE和聚酮合酶基因phlD，宿主菌为大肠杆菌。

优选地，所述乙醇脱氢酶基因phlD来源于大肠杆菌(Escherichia coli)，Genbank登录号为945837；所述突变的乙醇脱氢酶基因adhE其编码的氨基酸第267位由丙氨酸突变为苏氨酸，记为A267T，第568位由谷氨酸突变为赖氨酸，记为E568K；所述聚酮合酶基因phlD来源于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，Genbank登录号为3480329。

本发明的另一目的是提供一种上述重组菌的构建方法，步骤如下：

1)克隆获得乙醇脱氢酶基因adhE，将267位的丙氨酸突变为苏氨酸，568位的谷氨酸突变为赖氨酸，得到突变的乙醇脱氢酶基因adhE；克隆获得聚酮合酶基因phlD；

2)将步骤1)得到突变的乙醇脱氢酶基因adhE连接到质粒载体，获得重组质粒I；

3)将步骤1)所得的聚酮合酶基因phlD连接到质粒载体，获得重组质粒II；